Бактериологическая диагностика дисбактериоза методические рекомендации

Утверждаю

Заместитель Начальника
Главного управления научно-исследовательских институтов и
координации научных исследований Н.А.Демидов 14 апреля 1977
года

Методические рекомендации
подготовлены Московским научно-исследовательским институтом
эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР.

Введение

Тактика лечения любого
болезненного процесса зависит от знания его причин. В раскрытии
этиологии кишечных заболеваний решающее значение имеют результаты
бактериологического исследования. Особые трудности представляет
расшифровка острых, и особенно длительно протекающих кишечных
заболеваний, инфекционную природу которых нельзя доказать ни
бактериологически, ни эпидемиологически. А тот факт, что в
последние годы значительно ухудшились результаты антибиотикотерапии
кишечных заболеваний, является одним из аргументов против
инфекционной природы определенного числа кишечных расстройств.

Учитывая, что
этиологически нерасшифрованные заболевания составляют 40-50% общей
суммы кишечных расстройств, раскрытие их природы требует большого
внимания микробиологов, инфекционистов, эпидемиологов. Становится
очевидным, что проблема борьбы с кишечными заболеваниями требует
новых подходов для понимания причин дисфункции кишечника при
отсутствии выделения патогенных энтеробактерий – шигелл,
сальмонелл.

К
настоящему времени общепризнано, что при установлении природы
кишечных расстройств нельзя игнорировать значение состава
микрофлоры кишечника для его нормальной функциональной
деятельности. Макроорганизм и населяющая его микрофлора, в том
числе кишечника, являются сбалансированной экологической системой.
Более того, в самом кишечном биоценозе существуют коррелятивные
связи между отдельными родами, видами бактерий. Качественное или
количественное изменение одного из компонентов биоценоза оказывает
влияние на всю систему в целом. Нарушение же сложившегося в
процессе эволюции биологического равновесия между микробной флорой
и организмом не может быть для последнего безразличным. Поэтому при
затяжных кишечных заболеваниях следует учесть, что они могут
поддерживаться развившимся дисбактериозом кишечника. Это должно
явиться основанием для определения в этих случаях качественного и
количественного состава кишечной микрофлоры.

Накопленные наблюдения не
только об отсутствии эффекта от этиотропной терапии (антибиотиками,
химиопрепаратами) значительного числа острых, и особенно
хронических, кишечных заболеваний, но об усугублении и более
длительном течении болезненного процесса на фоне развившегося при
этом дисбактериоза кишечника привели к тому, что в последние годы
кишечные заболевания, связанные с дисбактериозом, получили
самостоятельное место в клинике.

Установление роли
дисбактериоза в патогенезе кишечных расстройств весьма важно и с
эпидемиологических позиций. Кишечные заболевания, развившиеся на
фоне дисбактериоза, не нуждаются в комплексе противоэпидемических
мероприятий, применяемых при заболеваниях инфекционной природы.

Таким образом,
показаниями к исследованию состояния кишечной бактериальной флоры
являются:

1. Длительно протекающие
кишечные расстройства, при которых не удается выделить патогенные
энтеробактерии;

2. Затянувшийся период
реконвалесценции после перенесенной острой дизентерии и других
кишечных инфекций;

3. Дисфункция кишечника
на фоне применения антибиотиков разными контингентами больных или
длительного контакта с антибактериальными препаратами (на
производстве антибиотиков, медперсонала и др.).

Первое издание
методических материалов по бактериологической диагностике
дисбактериоза кишечника 1969 года нашло применение как в
научно-исследовательских, так и в практических диагностических
лабораториях. Однако тираж первого издания не мог удовлетворить
запросы специалистов. Кроме того, за прошедший период накоплены
дополнительные материалы, которые вошли во второе издание.

1.
МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА

Организм человека
находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. Между
тем из огромного числа микроорганизмов, непрерывно попадающих в
пищеварительный тракт человека, только определенные роды, виды
микробов нашли в кишечнике человека благоприятные условия
существования; в процессе длительной эволюции они закрепились в
кишечнике и составили его облигатную микрофлору, выполняющую важные
для организма физиологические функции. Нельзя при этом не учесть,
что отдельные факторы, такие как характер питания, сезон года,
возраст, оказывают некоторое влияние на состав микрофлоры
кишечника. С возрастом, например, происходит сдвиг в сторону
увеличения грамположительной, гемолитической микрофлоры. Однако
колебания, связанные с этими воздействиями, невелики, а способность
здорового организма к саморегуляции обеспечивает быстрое
восстановление относительного постоянства нормального
биоценоза.

Из представителей
облигатной микрофлоры кишечника прежде всего следует назвать
бифидобактерии (Bifidobacterium) среди анаэробных микробов и
кишечную палочку (Escherichia) – среди аэробных.

Основную микрофлору
здоровых новорожденных детей, находящихся на естественном
вскармливании, составляют бифидобактерии, которые обнаруживаются в
больших разведениях фекалий (10-10). Количество их составляет 85-95% числа
всех микробов кишечника. Число кишечных палочек в стуле у этих
детей невелико. При переходе на прикорм и более разнообразную пищу
увеличивается количество кишечной палочки, ацидофильных микробов,
энтерококка. Вместе с тем в противовес существовавшему ранее
представлению о преобладании анаэробных микробов только у детей,
находящихся на грудном вскармливании, установлено, что полного
вытеснения бифидобактерии не происходит, в норме они продолжают
оставаться в толстом кишечнике в значительных количествах в течение
всей жизни человека. Основные различия микрофлоры детей раннего
возраста и старших контингентов в разных количественных
соотношениях бифидобактерий и кишечной палочки.

У
детей ясельного возраста аэробная кишечная микрофлора
характеризуется еще более высоким содержанием кишечной палочки,
энтерококка. У небольшого числа детей этого возраста выделяются
лактозодефективные энтеробактерии и стафилококк. Среди аэробных
энтеробактерий у здоровых детей, по данным Н.Д.Стерлиговой (1975),
в фекалиях обнаруживаются кроме эшерихий и другие
условно-патогенные бактерии семейства кишечных. Так, микробы рода
Proteus выделяют 6-7% детей, каждый из родов Citrobacter,
Enterobacter, Serratia – 1,0-1,4% здоровых детей. В анаэробной
микрофлоре, как и у детей раннего возраста, преобладают
бифидобактерии.

У
здорового взрослого человека, не принимавшего до исследования
антибиотиков и химиопрепаратов, основная аэробная микрофлора
представлена на 90-95% полноценной в ферментативном отношении
кишечной палочкой, которая разлагает в течение 18-20 часов лактозу
и растет на среде Эндо в виде темно-красных колоний с металлическим
блеском. Выделенные из этих колоний культуры расщепляют лактозу,
глюкозу, маннит, мальтозу с образованием кислоты и газа; редко
ферментируют сахарозу; образуют индол, сероводород, створаживают
молоко, обладают активной подвижностью. Среднее количество кишечной
палочки в 1 г фекалий составляет 300-400 млн. на средах Эндо и
Левина и 800 млн. на 5% кровяном агаре.

У
здоровых взрослых людей в 1,5% случаев обнаруживается кишечная
палочка со сниженными ферментативными свойствами в первой
генерации, которая растет на среде Эндо в виде бледно-розовых
колоний. При последующем пересеве (вторая генерация) выделенная
культура расщепляет лактозу до конца; количество ее в среднем
составляет 21 млн./г фекалий. Гемолизирующие эшерихии, как правило,
в фекалиях здоровых людей не обнаруживаются.

Лактозонегативные
энтеробактерии обнаружены у 5,1% обследованных здоровых лиц (в
среднем 24,9 млн./г). Последующая идентификация выделенных с
первичного посева культур как из лактозонегативных, так и
лактозоположительных колоний позволяет установить, что у взрослых
людей среди представителей аэробной микрофлоры обнаруживаются
различные роды условно-патогенных энтеробактерий, например,
Citrobacter – у 3%, Enterobacter – у 1-1,5% и т.д. Однако
определить количественное содержание каждого из указанных родов в 1
г фекалий не представляется возможным, так как подавляющее
большинство этих родовых групп условно-патогенных энтеробактерий
содержат варианты как ферментирующие, так и не ферментирующие
лактозу; поэтому в первичном посеве трудно определить процентное
содержание микробов каждого из этих родов энтеробактерий.

Энтерококк обнаружен у
20% взрослых людей при среднем количестве 634 млн./г. Энтерококк
представляет собой диплококки удлиненной формы, более полиморфные,
чем стрептококк и пневмококк; окрашивается положительно по Граму,
неподвижен, желатин не разжижает, молоко не створаживает.
Энтерококк в отличие от стрептококка дает в бульоне диффузный рост.
От стрептококка его можно дифференцировать по ряду тестов:
энтерококк разлагает маннит, растет на средах, содержащих 40%
желчи, в молоке с 0,1% метиленовой сини редуцирует последнюю,
устойчив к воздействию высокой температуры (до 60°).

Негемолизирующий и
гемолизирующий стафилококк выделяют 2,2-1,5% взрослых людей, при
этом средние числовые показатели негемолизующего стафилококка во
много раз больше, чем гемолизирующего – 417 млн./г и 90 млн./г
соответственно.

Грибы рода кандида почти,
как правило, в посевах фекалий здоровых людей не
обнаруживаются.

Молочнокислые микробы
представляют сборную группу микроорганизмов, в которую входят
ацидофильная и другие молочнокислые палочки, молочнокислые
стрептококки, стрептобактерии. Они окрашиваются по Граму
положительно, спор не образуют, неподвижны, молоко створаживают.
Молочнокислые микробы требуют для культивирования сложных по
составу питательных сред.

В
анаэробной микрофлоре кишечника здорового человека облигатными
являются бифидобактерии. Они обнаружены у 92,7% взрослых людей.
Количественное содержание их значительно: в 96,1% проб они выделены
из фекалий, разведенных до 10, т.е. в 1 г фекалий они составляют сотни
миллиардов микробных тел. Морфологически бифидобактерии имеют
разветвления на концах палочек, могут быть в форме римской цифры V
или гантелей с колбовидными утолщениями на концах, часто скопления
их имеют вид китайских иероглифов. Бифидобактерии окрашиваются по
Граму положительно (редко встречаются и грамотрицательные),
образуют кислоту без газообразования на средах с лактозой,
глюкозой, сахарозой; неподвижны, молоко не створаживают, индол и
сероводород не образуют, растут только в анаэробных условиях, спор
не образуют.

При посевах фекалий в
анаэробных условиях вырастает также значительное количество
бесспоровых грамотрицательных палочек, которые объединены в группу
бактероидов. Палочки весьма полиморфны, могут иметь и кокковидную
форму. Эта группа микробов очень мало изучена. В отношении их нет
четкой классификации. О физиологической роли бактероидов для
организма человека сведений достаточных нет. Слабая изученность
этой группы бактерий объясняется трудностями культивирования –
применения сложных питательных сред и условий строгого
анаэробиоза.

Физиологическое значение
нормобиоценоза велико и многообразно. Кишечная палочка,
бифидобактерии характеризуются высокоантагонистическими свойствами,
препятствующими развитию патогенных и ряда необычных для нормальной
микрофлоры кишечника условно-патогенных микробов; тем самым
барьерное действие нормальной микрофлоры кишечника можно
рассматривать как один из факторов естественной резистентности
организма. Известна также витаминообразующая функция нормальной
микрофлоры кишечника – способность синтезировать ряд витаминов,
особенно группы В. Нормальная микрофлора кишечника участвует в
ферментативных процессах в толстом кишечнике, в частности в
процессе расщепления кишечных ферментов – энтерокиназы и щелочной
фосфатазы. Таким образом, нормальная кишечная микрофлора
способствует поддержанию постоянства биохимической и биологической
среды пищеварительного аппарата, обеспечивает его нормальное
функционирование.

2.
ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ДИСБАКТЕРИОЗЕ КИШЕЧНИКА

Термином “дисбактериоз”
кишечника определяют такие ассоциации микроорганизмов, которые
качественно или количественно либо одновременно в том и другом
направлении отличаются от нормального состава микрофлоры за счет
исчезновения или снижения числа облигатных ее представителей, с
одной стороны, увеличения числа энтеробактерий, отсутствующих или
встречающихся в ничтожных количествах в норме, с другой. В итоге
такие микробные ассоциации не в состоянии выполнить физиологические
функции, осуществляемые нормальным биоценозом кишечника.

К
настоящему времени уже известен ряд условий, при которых
развивается дисбактериоз кишечника. Это прежде всего при кишечных
инфекционных заболеваниях, в частности при дизентерии; при любых
других заболеваниях, изменяющих реактивность организма.
Клиническими наблюдениями и прямыми экспериментами на животных
установлены нарушения нормальной микрофлоры также под влиянием
антибиотиков, химиопрепаратов, лучевых воздействий.

Широкое распространение в
последние годы дисбактериоза кишечника определяет его важное
значение в клинике кишечных расстройств. А.Ф.Билибин трактует
дисбактериоз как состояние срыва адаптации, ведущее к нарушению
защитных и компенсаторных механизмов. Надо полагать, это имеет
особенное значение в раннем детском возрасте при незрелости
специфических и неспецифических факторов резистентности.

Что касается
характеристики микробных ассоциаций при дисбактериозе кишечника, то
таковые не однозначны. При одинаковой клинике могут быть разные
микробные ассоциации, и наоборот. Однако можно полагать, что в
любом случае снижение числа облигатной микрофлоры, обладающей
высокой антагонистической активностью, создает условия для развития
тех родов и видов энтеробактерий, размножение которых в нормальных
условиях было подавлено конкуренцией активных симбионтов, либо тех
микроорганизмов, которые оказались транзиторно в кишечнике. Чаще
всего в этих условиях развиваются микробы, которые обладают высокой
резистентностью к антибиотикам и менее требовательны к условиям
размножения, а именно: гноеродные микробы, в первую очередь
стафилококк, гнилостные (микробы рода протея и др.); грибы рода
кандида.

У
лиц с дисфункцией кишечника на фоне дисбактериоза в микробных
ассоциациях могут присутствовать также условно-патогенные микробы
семейства кишечных, которые не являются элементами облигатной
микрофлоры, вместе с тем обнаруживаются и у здоровых людей. Так,
при исследовании 1500 проб фекалий от детей с кишечными
расстройствами (Стерлигова, 1975) микробы рода Hafnia были выделены
в 10,9% проб, Aerobacter – в 4,2%, Citrobacter – в 3,9%, Klebsiella
– в 0,9%, Arisona – в 0,9%, Serratia – в 0,5% проб против 6,6% –
1,4% – 1%, 1,4% – 0 – 1% соответственно у здоровых.

Важно при этом
подчеркнуть, что при огромном числе накопленных наблюдений о
характере микрофлоры при дисбактериозе не описано замещение
нормальной микрофлоры одним каким-либо видом (родом) микробов. Как
правило, дисбактериоз характеризуется тоже ассоциацией разных
представителей энтеробактерий, но по составу отличной от
нормобиоценоза. Более того, состав микрофлоры при дисбактериозе
гораздо более пестрый и содержит до 5 и более родов, не характерных
для нормальной микрофлоры. Широкие ассоциации условно-патогенных
микробов часто сочетаются с более выраженной клиникой кишечного
заболевания.