Цвет колоний кишечной палочки при росте на среде эндо

Оглавление темы “Эшерихии. Эшерихиозы. Кишечная палочка. Шигеллы. Дизентерия.”:

1. Диагностика энтеробактерий. Выявление энтеробактерий. Диагностические подходы для энтеробактерий.

2. Эшерихии. Эшерихиозы. Свойства эшерихий. Кишечная палочка. Escherichia coli. Морфология кишечной палочки. Культуральные свойства кишечной палочки.

3. Биохимические свойства кишечной палочки. Антигены кишечной палочки. Антигенная структура кишечной палочки. Серовары кишечной палочки.

4. Патогенез поражений кишечной палочкой. Клинические проявления коли инфекции. Кишечные инфекции ( коли-инфекции ). Энтеротоксигенные кишечные палочки.

5. Энтероинвазивные кишечные палочки. Энтеропатогенные эшерихии. Энтерогеморрагические кишечные палочки.

6. Энтероадгезивные кишечные палочки. Уропатогенные эшерихии. Инфекции мочевыводящих путей вызванные кишечной палочкой. Бактериемия эшерихий.

7. Менингит вызванный кишечной палочкой. Респираторные инфекции вызванные эшерихиями ( кишечной палочкой ).

8. Микробиологическая диагностика кишечной палочки. Диагностика кишечной палочки. Выявление эшерихий.

9. Лечение эшерихиозов. Лечение кишечной инфекции. Профилактика эшерихиозов. Профилактика кишечной инфекции.

10. Шигеллы. Дизентерия. Бактериальная дизентерия. Шигеллез. История дизентерии. Серовары шигелл. Серовары возбудителей дизентерии.

Эшерихии. Эшерихиозы. Свойства эшерихий. Кишечная палочка. Escherichia coli. Морфология кишечной палочки. Культуральные свойства кишечной палочки.

Своё название бактерии получили в честь немецкого педиатра Т. Эшериха, впервые выделившего Escherichia coli из содержимого кишечника детей. Род образуют подвижные (перитрихи) прямые палочковидные бактерии размером 1,1-1,5×2,0-6,0 мкм. В мазках они располагаются одиночно или парами. У большинства штаммов существуют капсулы или микрокапсулы.

Температурный оптимум для роста эшерихий 37 °С. Эшерихии ферментируют углеводы с образованием кислоты или кислоты и газа, оксидаза-отрицательны и каталаза-положительны.

Эшерихии входят в состав микрофлоры толстой кишки теплокровных, пресмыкающихся, рыб и насекомых. Эшерихии – основная аэробная микрофлора кишечника, вызывающая, однако, обширную группу заболеваний человека, известных как эшерихиозы.

Эшерихиозы характеризуются не только клиническим полиморфизмом, но и создают особую эпидемиологическую ситуацию. Основное медицинское значение имеет кишечная палочка (Escherichia coli). Кишечные палочки рассматривают как санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) при анализе воды и пищевых продуктов.

Кишечная палочка. Escherichia coli

В настоящее время среди прочих энтеробактерии кишечная палочка – основной возбудитель эшерихиозов у человека.

Морфология кишечной палочки. Культуральные свойства кишечной палочки

Кишечная палочка имеют типичную для энтеробактерий форму и представлены короткими подвижными палочками с закруглёнными концами.

• На плотных средах бактерии образуют плоские выпуклые мутные S-колонии с ровными или слегка волнистыми краями (3-5 мм в диаметре) либо сухие плоские R-колонии с неровными краями.

• В жидких средах растут диффузно, вызывая помутнение среды и образование осадка (реже формируют поверхностную плёнку или пристеночное кольцо).

• На средах Хисса кишечная палочка может образовывать газ. На селективно-дифференциальных средах колонии принимают цвет, соответствующий окраске среды. На агаре Эндо лактоза-положительные эшерихии образуют фукс и ново-красные колонии с металлическим блеском, лактоза-отрицательные – бледно-розовые или бесцветные с тёмным центром. На среде Левина бактерии формируют тёмно-синие колонии с металлическим блеском, а лактоза-отрицательные – бесцветные, на среде Плоскирева – соответственно красные с жёлтым оттенком или бесцветные. На КА могут давать полный гемолиз.

– Также рекомендуем “Биохимические свойства кишечной палочки. Антигены кишечной палочки. Антигенная структура кишечной палочки. Серовары кишечной палочки.”

Источник

В группу БГКП входят представители нескольких родов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Эти микроорганизмы обладают многими общими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Бактерии группы кишечных палочек – короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные и неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Бактерии этой группы хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (Е. aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (В. paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других Сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые нормируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

В соответствии с ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа» бактерии группы кишечных палочек (БГКП, коли-формы) – это микроорганизмы семейства энтеробактерий родов эшерихия, цитробактер, энтеробактер, клебсиела, серратия; бесспоровые, грамотрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа.

На этих свойствах основано определение БГКП в молочных продуктах в средах Кесслер (в соответствии с 32901-2014 по образованию газа) или Кода (по изменению цвета индикатора) после термостатирования при температуре 37±1°С в течение 24 ч, а для мороженого – 48 ч. Дифференциально- диагностическая – среда Эндо, на которой Е. coli образует красные колонии с металлическим блеском. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний говорит о принадлежности микроорганизмов к лакгозоотри- цательным, в том числе патогенным энтеробактериям.

Санитарно-показательное значение родов неодинаково: наличие эшери хий свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении, цитробактер и энтеробактер (иногда их считают измененными эшерихиями под влиянием пребывания во внешней среде) – показатели давнего или нефекального загрязнения.

В молоке БГКП хорошо размножаются, доводя его кислотность до 50- 80°Т и образуя в нем неровный ноздреватый сгусток. Молочнокислые микроорганизмы замедляют развитие БГКП. При режимах пастеризации, принятых в молочной промышленности, БГКП гибнут. Обычные дезинфицирующие средства полностью обеззараживают оборудование, инвентарь, руки от БГКП.

Дифференциацию БГКП можно проводить с помощью специальных тестов (комплекс признаков ТИМАЦ + Л):

Т – температурный тест (тест Эйкмана, выявляет способность эшери- хий ферментировать глюкозу, лактозу, маннит с образованием газа при 44- 45°С, другие не обладают такой способностью);

И- индолообразование (способность эшерихий расщеплять аминокислоту триптофан с выделением индола);

М – реакция с метиловым красным, заключается в определении кислотообразования при ферментации глюкозы: если индикатор изменяет светло-желтый цвет на красный, это свидетельствует о снижении рН до 5 и о наличии эшерихий и цитробактер, энтеробактер не изменяет цвет индикатора;

А- реакция на ацетилметилкарбинол (ацетоин), выявляет способность микроорганизмов образовывать это вещество в среде с глюкозой; проводится качественная реакция с гидроксидом калия и креатином, дающая розовый цвет, такой способностью обладают только представители рода цитробактер;

Ц – цитратный тест (способность микроорганизмов усваивать в качестве единственного источника углерода лимонную кислоту или ее соли, используют среду Козера с цитратами, цитробактер и энтеробактер растут на таких средах, называются цитратположительными бактериями, эшерихии – нет);

Л – лактозный тест (способность ферментировать лактозу).

Основные (наиболее стабильные) тесты – температурный и цитратный.

При воздействии факторов внешней среды (например, в присутствии антибиотиков) свойства БГКП могут меняться. Для дифференциации видов дополнительно определяют уреазную активность, рост на средах с цианистым калием, ферментацию различных углеводов, используют специальные таблицы.

Критерии санитарной оценки молочных продуктов и других объектов по присутствию СПМ предусмотрены действующими ГОСТ и СанПиН. Использовавшийся ранее показатель бродильного титра заменен показателем отсутствия БГКП в определенной массе продукта. Так, например, в пастеризованном молоке БГКП должны отсутствовать в 0,01 см, в ультрапастеризованном молоке – в 10 см3, ряженке – в 1 г, в кефирной закваске – в 3 мл, в твороге – в 0,001 г.

Источник

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме – 80 мин

1. Общая характеристика бактерий кишечного семейства

2. Характеристика кишечных палочек

3. Категории кишечных палочек

4. Роль кишечной палочки для организма человека.

5. Классификация кишечных палочек

6. Лабораторный диагноз острых кишечных инфекций

7. Специфическая терапия острых кишечных инфекций

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение мазков из чистой культуры кишечной палочки, окрашенных по Граму (зарисовать)

Вмазке из чистой культуры видны маленькие прямые палочки с закругленными концами, располагаются обычно бессистемно, грамотрицательные.

2. Изучение роста кишечной палочки на среде Эндо (зарисовать).

На среде Эндо кишечная палочка образует выпуклые колонии ма­линово-красного цвета с металлическим блеском или без него. Среда Эндо – дифференциально-диагностическая среда. Кроме питательной основы, среда содержит 1% лактозу и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина, обесцвеченного перед добавлением к агару раст­вором сульфита натрия. Свежеприготовленная среда Эндо бесцветна или слегка розовая. При росте на этой среде кишечная палочка разлагает лактозу, образуются кислые продукты, они восстанавливают фуксин из бесцветного соединения в красный и поэтому вырастают колонии, окрашенные в малиново-красный цвет.

3. Изучение биохимических изменений на пестром ряду (таблица) с посевом кишечной палочки (записать в тетрадь табл.2):

Таблица 2

Ферментативные свойства кишечной палочки

Примечание: К Г -ферментация углевода сообразованием кислоты и газа, (-) -отсутствие ферментации или образования

Ферментативная активность изучена на пестром ряду. Кроме питательной основы и углевода к среде добавлен индикатор бромкрезолпурпур. Исходный цвет среды фиолетовый, при образовании кислоты цвет среды становится желтым. Газообразование улавливают с помощью поплавков – коротких стеклянных трубочек, запаянных с одного конца, помещенных в питательную среду, открытым концом вниз. Образование индола определено с помощью реактива Ковача: при положительной реакции конец бумажки окрашивается в малиново-розовыйцвет.

4. Знакомство со схемой лабораторного диагноза эшерихиоза по схеме (зарисовать табл.3)

Среди кишечных палочек встречаются представители, которые способны вызывать заболевания кишечника, варьирирующие от умеренной диареи до тяжелого холероподобного заболевания. В основном заболевания возникают у детей 1 года жизни, но могут возникать также у детей старшего возраста и взрослых.

Кишечные палочки, вызывающие поражения кишечника, разделяют на три группы:

1. Энтеропатогенные кишечныепалочки (ЭПКП) – поражают детей первого года жизни, особенно часто в коллективах (серогруппы 026,055, 0111 и др.)

2. Энтеротоксигенные кишечные палочки (ЭТКП) – поражают детей старше года и взрослых людей (серогруппы 01,05,06 и др.). Эта группа кишечных палочек характеризуется способностью продуцировать энтеротоксин, который реагирует с аденилциклазной системой клеток эпителия слизистой тонкого кишечника, нарушает их функции вызывает холероподобные заболевания.

3. Энтероинвазионные кишечные палочки (ЭИКП) – поражают детей старше года и взрослых людей (серогруппы 025,0124 и др.) Эта группа кишечных палочек обладает способностью к инвазии в клетки слизистой оболочки толстой кишки и вызывает дизентериеподобные заболевания.

Помимо перечисленных заболеваний, которые могут принимать эпи­демический характер, кишечные палочки могут вызывать аппендицит, перитонит, цистит, пиелонефрит и т.д. В последние годы нередко ки­шечные палочки самостоятельно или в ассоциациях с другими бактери­ями вызывают внутрибольничные инфекции в хирургических, педиатри­ческих стационарах и др.

Кишечные палочки, выделяемые от больных различными заболева­ниями, как кишечной, так и не кишечной локализации, невозможно раз­личить от представителей нормальной микрофлоры ни по морфологичес­ким, ни по культуральным свойствам. Дифференциация их проводится на основе антигенной структуры.

Главной особенностью ЭПКП является антигенная структура, по­стоянная и характерная для каждого штамма. Учитывают соматический 0-антиген, соматический К-антиген и жгутиковый Н-антиген.

Общепризнано, что поставить клинический диагноз острой кишеч­ной инфекции нельзя. Обязательна постановка лабораторного диагноза. Основным в лабораторной диагностике является бактериологический диагноз.

Исследуемый материал: испражнения, рвотные массы.

Испражнения в количестве 3-5 гр. помещают в пробирку с изото­ническим раствором хлорида натрия или глицериновой смесью. Целесо­образно брать последние порции, т.к. при колиэнтеритах поражается тонкий кишечник. У грудных детей материал для исследования берут с пеленок. Чем раньше от начала заболевания исследуют испражнения, тем вероятнее возможность выделения возбудителя. Рекомендуется за­бор материала сделать до начала лечения.

Бактериологический метод. Бактериологический диагноз основан на выделении чистой куль­туры и определении её серовара.

Исследуемый материал засевают на среду Эндо, предварительно разведя его физ. раствором. Через сутки изучают колонии, выросшие на среде. Кишечные палочки вырастают на среде Эндо в виде малиново-красных колоний с металлическим блеском или без него. Отбор ко­лоний патогенных кишечных палочек проводят с помощью ориентировоч­ной реакции агглютинации с диагностической сывороткой. Употребляют смесь ОКБ – сывороток против патогенных кишечных палочек, соединяя не более 5 сывороток. Для постановки ориентировоч­ной реакции агглютинации исследуют не менее 10 колоний. Если ни одна из них не агглютинирует, дают ответ: “Патогенные кишечные палочки не обнаружены”. Из колоний с положительной реакцией агглю­тинации делают посев в пробирки со средой Олькеницкого (Клиглера) или скошен­ным агаром и ставят в термостат на 18-20 часов.

На следующий день (3 день исследования) просматривают посевы на среде Олькеницкого и скошенном МПА. Состав среды Олькеницкого (трехсахарная среда с мочевиной): к 100 г МПА расплавленного и охлажденного добавляют I г лактозы, I г сахарозы, 0,1 г глюкозы, I г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита и индикатор ВР (водный голубой и розоловая кислота). Среду разливают так, что­бы был столбик и скошенная поверхность. Посев культуры делают штрихом на скошенную поверхность и уколом в глубину столбика. Фер­ментация глюкозы происходит в анаэробных условиях (её в среде мало), в этом случае цвет изменится только в столбике (среда поси­неет). При ферментации лактозы или сахарозы среда посинеет как в столбике, так и на скошенной поверхности. При разложении мочеви­ны (рН сдвигается в щелочную сторону) цвет среды станет оранжевым. Газообразование определяют по разрывам среды. При образовании сероводорода среда чернеет.

На скошенном МПА энтеропатогенные кишечные палочки образуют влажный блестящий сероватый налет.

На среде Олькеницкого кишечная палочка вызывает посинение среды, как в столбике, так и на скошенной поверхности, наблюдают­ся разрывы среды пузырьками газа (ферментация лактозы и глюкозы до кислоты и газа). Выделенную культуру проверяют в реакции аг­глютинации на стекле сначала с той же смесью сывороток, а затем раздельно с каждой сывороткой, входящей в смесь.

При отсутствии реакции агглютинации дают отрицательный ответ. При положительной реакции агглютинации необходимо подтвердить при­надлежность выделенной культуры к роду кишечных палочек. Для этого культуру засевают на жидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, в пробирку с МПБ для обнаружения индола и серово­дорода, определяют подвижность.

Для окончательной идентификации выделенной эшерихии ставят развернутую реакцию агглютинации с типовой коли-ОКВ-сывороткой. Реакцию ставят с живой культурой для установления К-антигена и с гретой культурой для установления О-антигена.

По результатам пестрого ряда и развернутой реакции агглютина­ции может быть дан окончательный ответ.

Серологическая диагностика при кишечных инфекциях использует­ся для подтверждения этиологического значения выделенных эшерихий, заподозренных в качестве возбудителя, в научно-исследовательских целях для изучения патогенеза и иммунитета кишечных заболеваний.

Основана она на обнаружении антител в сыворотке крови. Обна­руживают О-антитела в реакции агглютинации, используя в качестве антигена культуру, выделенную от больного и кипяченую в течение 2 часов. Положительная реакция проявляется непостоянно, титр антител невысокий – ниже 1:100. В-антитела не обнаруживаются.

Можно использовать реакцию пассивной гемагглютинации, которая более чувствительна. В качестве диагностикума используют эритроци­ты барана, сенсибилизированные смывом 48-часовой культуры, кипяче­ной 2 часа. Следовательно, в РПГА также выявляют только О-антитела. Эта реакция позволяет отличить больных от людей, выделяющих энтеропатогенные кишечные палочки без клинических проявлений болезни. У последних антитела не обнаруживаются.

Ускоренные методы лабораторной диагностики. Классическое бактериологическое исследование длится 4-5 дней. Это не всегда устраивает и клиницистов и эпидемиологов, по­этому прилагается много усилий, чтобы сократить время исследова­ния и ускорить ответ лаборатории. Для решения этой проблемы пред­ложено использовать наиболее рациональные питательные среды, сокра­щать интервалы между исследованиями, а также применять методы, ос­нованные на определении антигенной структуры кишечных палочек. На­иболее чувствительным и быстрым методом является метод иммунофлюоресценции, основанный на обнаружении специфического антигена кишеч­ных палочек в исследуемом материале с помощью флюоресцирующих антител.

Этапы бактериологического исследования

при подозре­нии на эшерихиоз

Первый день

1. Сделать посев испражнений больного на среду Эндо. Для этого взять немного материала пипеткой и эмульгировать его в физиологическом растворе или глицериновой смеси, каплю эмульсии нанести на среду Эндо петлей или пипеткой. Стерильным шпателем растереть каплю на небольшом участке среды, затем, не прожигая шпатель, втереть оставшийся на нем материал по всей поверхности. Чашки с посевом поставить в термостат на 24 часа.

Второй день

2. Изучить посевы на среде Эндо, описать выросшие колонии.

Отобрать малиново-красные колонии с металлическим блеском или без него с помощью ориентировочной реакции агглютинации (не менее 10). Для постановки реакции стерильной петлей взять часть колонии и смешать с каплей агглютинирующей диагностической поливалентной сыворотки. Поливалентные сыворотки готовят в производственных условиях, они содержат антитела к нескольким сероварам эшерихий из одной серологической группы. При положительной реакции агглютинации оставшуюся часть колоний отсеять на скошенный агар или среду Олькеницкого. Если же ни одна из десяти колоний не дала агглютинации, выдать отрицательный ответ.

Третий день

3. Изучить посевы на скошенном агаре и среде Олькеницкого.

3.1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой. Если реакция агглютинации положительна, поставить реакцию агглютинации на стекле с каждой типовой сыворот­кой, входящей в поливалентную.

3.2. Подтвердить принадлежность выделенной культуры к эшерихиям. Для этого изучить ферментативные свойства, сделав посев на жидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой. Сделать также посев на МПБ для определения образования индола и сероводорода.

3.3. Провести окончательную серологическую идентификацию культуры. Для этого поставить развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой культурой. Диагностическую типовую сыворотку разводят от 1:100 до тит­ра сыворотки, указанного на этикетке. Из разведений приготовить два ряда пробирок. Приготовить антиген. Для этого смыть культуру с поверхности среды 3-5 мл физиологического раствора, разлить взвесь в 2 стерильные пробирки. Одну из них прогреть на водяной бане при 100°С в течение часа. В первый ряд разведений сыворотки внести по 2 капли живой культуры, во второй – по 2 капли гретой культуры. После встряхивания пробирки поместить в термостат на 18-20 часов.

Четвертый день

Учет результатов. Заключение по исследованию

4.1. Просмотреть посевы на пестром ряду. Для кишечной палочки ха­рактерна ферментация лактозы, глюкозы, мальтозы и маннита с обра­зованием кислоты и газа, отсутствие ферментации, сахарозы, образо­вание индола. Учет реакции агглютинации провести с помощью лупы. Агглютинация с живой культурой крупнохлопчатая (Н-агглютинация), с убитой – мелкозернистая (О-агглютинация).

Таблица 3

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Источник