Для каких кишечных палочек не характерно сбраживание лактозы

В группу БГКП входят представители нескольких родов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. Эти микроорганизмы обладают многими общими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Бактерии группы кишечных палочек – короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные и неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Бактерии этой группы хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (Е. aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки (В. paracoli) характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.

Большинство бактерий группы кишечных палочек (БГКП) не разжижают желатина, свертывают молоко, расщепляют пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других Сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые нормируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.

В соответствии с ГОСТ 32901-2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа» бактерии группы кишечных палочек (БГКП, коли-формы) – это микроорганизмы семейства энтеробактерий родов эшерихия, цитробактер, энтеробактер, клебсиела, серратия; бесспоровые, грамотрицательные, аэробные и факультативно-анаэробные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа.

На этих свойствах основано определение БГКП в молочных продуктах в средах Кесслер (в соответствии с 32901-2014 по образованию газа) или Кода (по изменению цвета индикатора) после термостатирования при температуре 37±1°С в течение 24 ч, а для мороженого – 48 ч. Дифференциально- диагностическая – среда Эндо, на которой Е. coli образует красные колонии с металлическим блеском. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний говорит о принадлежности микроорганизмов к лакгозоотри- цательным, в том числе патогенным энтеробактериям.

Санитарно-показательное значение родов неодинаково: наличие эшери хий свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении, цитробактер и энтеробактер (иногда их считают измененными эшерихиями под влиянием пребывания во внешней среде) – показатели давнего или нефекального загрязнения.

В молоке БГКП хорошо размножаются, доводя его кислотность до 50- 80°Т и образуя в нем неровный ноздреватый сгусток. Молочнокислые микроорганизмы замедляют развитие БГКП. При режимах пастеризации, принятых в молочной промышленности, БГКП гибнут. Обычные дезинфицирующие средства полностью обеззараживают оборудование, инвентарь, руки от БГКП.

Дифференциацию БГКП можно проводить с помощью специальных тестов (комплекс признаков ТИМАЦ + Л):

Т – температурный тест (тест Эйкмана, выявляет способность эшери- хий ферментировать глюкозу, лактозу, маннит с образованием газа при 44- 45°С, другие не обладают такой способностью);

И– индолообразование (способность эшерихий расщеплять аминокислоту триптофан с выделением индола);

М – реакция с метиловым красным, заключается в определении кислотообразования при ферментации глюкозы: если индикатор изменяет светло-желтый цвет на красный, это свидетельствует о снижении рН до 5 и о наличии эшерихий и цитробактер, энтеробактер не изменяет цвет индикатора;

А– реакция на ацетилметилкарбинол (ацетоин), выявляет способность микроорганизмов образовывать это вещество в среде с глюкозой; проводится качественная реакция с гидроксидом калия и креатином, дающая розовый цвет, такой способностью обладают только представители рода цитробактер;

Ц – цитратный тест (способность микроорганизмов усваивать в качестве единственного источника углерода лимонную кислоту или ее соли, используют среду Козера с цитратами, цитробактер и энтеробактер растут на таких средах, называются цитратположительными бактериями, эшерихии – нет);

Л – лактозный тест (способность ферментировать лактозу).

Основные (наиболее стабильные) тесты – температурный и цитратный.

При воздействии факторов внешней среды (например, в присутствии антибиотиков) свойства БГКП могут меняться. Для дифференциации видов дополнительно определяют уреазную активность, рост на средах с цианистым калием, ферментацию различных углеводов, используют специальные таблицы.

Критерии санитарной оценки молочных продуктов и других объектов по присутствию СПМ предусмотрены действующими ГОСТ и СанПиН. Использовавшийся ранее показатель бродильного титра заменен показателем отсутствия БГКП в определенной массе продукта. Так, например, в пастеризованном молоке БГКП должны отсутствовать в 0,01 см, в ультрапастеризованном молоке – в 10 см3, ряженке – в 1 г, в кефирной закваске – в 3 мл, в твороге – в 0,001 г.

Впервые Escherihia coli (кишечную палочку) Т.Эшерих выделил в 1885 г из фекалий больного. Кишечная палочка является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека, млекопитающих, птиц и рыб. Среди бактерий E. сoli наряду с сапрофитными штаммами встречаются энтеропатогенные, способные вызвать желудочно-кишечные заболевания людей и животных.

Морфология. Это полиморфные палочки с закругленными концами длиной 1-3 мкм, грамотрицательные, не образующие спор, подвижные перитрихи (встречаются и неподвижные). Капсулу образуют лишь патогенные серовары (08, 09, 0101).

Культуральные свойства. Е. coli аэроб или факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37-380С, рН среды 7,0-7,4. Хорошо растет на обычных питательных средах – МПА, МПБ, средах Эндо и Левина. На МПА через 24 ч появляются сочные, круглые с ровными краями и гладкой поверхностью (s-форма) серо-белого цвета колонии. В МПБ образуют интенсивное помутнение среды и осадок на дне пробирки, легко разбивающийся при встряхивании.

Биохимические (ферментативные) свойства у бактерий E. сoli хорошо выражены, в отличие от других бактерий семейства Enterobacteriaciae они сбраживают лактозу до кислоты и газа, что используется для дифференциации и идентификации.

К бактериям группы кишечной палочки отнесены 3 рода бактерий: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter. Два последних рода близки, в отличие от рода Escherihia они имеют ограниченное санитарное значение и не расцениваются как показатели свежего фекального загрязнения, так как их чаще обнаруживают в почве, на растениях.

Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечных палочек сбраживать лактозу, так как считалось, что средой обитания лактозоотрицательных палочек являются почва, вода, растения.

В связи с неодинаковым санитарно-показательным значением отдельных родов в настоящее время для дифференциации Escherihia coli фекального происхождения от других БГКП (Citrobacter и Enterobacter) предложен комплекс признаков обозначенных абревиатурой – ТИМАЦ.

Т – температурный тест (тест Эйкмана);

И– тест на индолообразование;

М– реакция с метиловым красным;

А– реакция на ацетиметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра);

Ц– цитратный тест.

Признаки, входящие в этот комплекс, определяют принадлежность БГКП к одному из трех родов: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter.

Температурный тест. Для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов Escherihia coli, принимают ее способность сбраживать углеводы при температуре 43-440С, превышающей температуру тела человека, т.е. температурный тест. Большинство бактерий родов Citrobacter и Enterobacter такой способностью не обладает.

Образование индола. Суть метода сводится к тому, что 98% выделенных штаммов Escherihia coli способны расщеплять аминокислоту триптофан, входящую в состав многих белков и пептонов питательной среды, с выделением ряда продуктов, в том числе и индола, окрашивающего питательную среду в красный цвет при взаимодействии с реактивами, содержащими параметиламидобензальдегид. Бактерии из родов Citrobacter и Enterobacter индол не образуют.

Реакция с метиловым красным(реакция Кларка). Эта реакция применяется для определения интенсивности кислотообразования при сбраживании глюкозы в питательной среде. В качестве индикатора используют метиловый красный, который изменяет окраску от светло-желтой до красной при рН 5,0 и ниже (при рН выше 5,0 среда остается светло-желтой). Считается, что типичные Escherihia coli сбраживают глюкозу до кислоты и газа более интенсивно, чем Enterobacter.

Образование ацетилметилкарбинола.С помощью этой реакции определяют способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол. Его образуют Enterobacter, а Escherihia coli и Citrobacter такой способностью не обладают.

Способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол определяют по следующей методике: к 5 мл культуры 4-5 суточного возраста, выращенной на пептонной воде с глюкозой или на среде Кларка, добавляют такой же объем 40%-ного раствора КОН. При наличии ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет.

Цитратный тестоснован на способности некоторых микроорганизмов усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде.

Citrobacter и Enterobacter растут на цитратных средах и получили название цитратположительные бактерии, а Escherihia coli фекального происхождения не утилизируют цитрат и являются цитратотрицательными.

ГОСТом предусмотрено проведение цитратного теста при контроле молока и молочных продуктов на среде Козера.

Сбраживание лактозы.Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечной палочки сбраживать лактозу. Этот признак был дифференцирующим при определении санитарно-показательного значения изучаемых микроорганизмов. Считалось, что лактозоотрицательные варианты отличаются от лактозоположительных тем, что средой обитания их являются почва, вода, растения.

Однако в кишечнике человека и животных, а также во внешней среде можно обнаружить различные варианты кишечных палочек, которые имеют не типичные для рода Escherihia признаки. Это объясняется тем, что у кишечной палочки, под влиянием различных факторов внешней среды происходит изменение ряда биологических свойств: утрата способности сбраживать лактозу и ферментировать углеводы при 430С и даже при 370С.

Следовательно, этот признак нестабильный, поэтому внастоящее времяпри классификации или для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов кишечной палочки определяют способность не просто сбраживать лактозу, а способность сбраживать углеводы при температуре, превышающей температуру тела человека и животных, т.е. температурный тест.

В комплексе ТИМАЦ температурный и цитратный тесты являются основными, наиболее стабильными позволяющими дифференцировать БГКП фекального происхождения от бактерий группы кишечных палочек, обитающих во внешней среде.

Выявление БГКП в пищевых продуктах свидетельствует об их фекальном загрязнении. БГКП могут попадать в продукты из воды, с оборудования, рук рабочего персонала и из других источников. БГКП подразделяют на две подгруппы:

• 1) общие колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу, лактозу и маннит с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24 ч;
• 2) термотолерантные колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 43—44,5°С.

В группу БГКП входят роды Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia (табл. 12.2).

Род Escherichia. Типовым видом этого рода является Escherichia coli. Он играет важную роль в микробиоценозе кишечника человека и животных.

Е. coli — мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами размером (2—3) х (0,5—0,7) мкм. Не образуют спор, неподвижны. Есть варианты подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков, капсул не имеют. Факультативные анаэробы. Получают энергию как в процессе дыхания, так и при брожении. При сбраживании углеводов Е. coli накапливают кислоты — молочную, уксусную, янтарную (положительная реакция с метиловым красным) и газы — С02 и Н2 (бродильная проба). Эшерихии хорошо растут на простых питательных средах. Оптимальная температура роста составляет 37°С, оптимальное значение pH среды — 7,0-7,4.

Таблица 12.2

Признаки родов, относящихся к БГКП

Род Enterobacter. Представители рода обнаруживаются в пресной воде, почве, сточных водах, на растениях, овощах; их выделяют из кишечника человека и животных. Виды рода в последние годы выделяют при острых желудочно-кишечных заболеваниях, диспепсии, инфекциях желчных и мочевых путей, гнойных поражениях мозговых оболочек, сепсисе у людей и животных. Типовой вид — Е. cloacae.

Клетки Enterobacter — прямые палочки размером (2—3) х (0,5— 0,6) мкм, перитрихи, грамотрицательные, не образуют спор и капсул. Оптимальная температура роста 30—37°С. Биохимические признаки видов этого рода: образование ацетоина при сбраживании углеводов (положительная реакция Фогес—Проскауэра), расщепление цитрата натрия в среде Симмонса.

Род Citrobacter (citrus — (лимон) и bacter). Представители этого рода присутствуют в фекалиях человека и животных, почве, сточных водах, пищевых продуктах. При определенных условиях они могут вызывать заболевания, протекающие по типу гастроэнтеритов, диспепсий. При развитии гнойно-воспалительных процессов наиболее значимым является вид C.freundii, который является типовым видом данного рода. Клетки цитробактеров — прямые палочки размером (1—6) х (0,5—0,8) мкм, одиночные или в парах. Перитрихи. Спор и цист не образуют, капсул не образуют. С. freundii продуцирует сероводород. На кровяном агаре вокруг колоний образуются четкие зоны гемолиза.

Род Klebsiella назван в честь бактериолога Э. Клебса. Бактерии этого рода выделяют из воды, почвы, пищевых продуктов. Они присутствуют в биоценозах носоглотки, кишечника. Вызывают заболевание клебсиеллез у детей в возрасте до 1 года. Заболевание протекает в виде диареи, менингита, бронхопневмонии, гнойносептических воспалений. Представители рода: К. pneumonia,

К. mobilis и сапрофитные виды: К. planticola, К. terrigena. Это прямые палочки размером (0,6—6,0) х (0,3—1,0) мкм, одиночные или в парах. Отличаются от других энтеробактерий характерными признаками: обладают классической полисахаридной капсулой и лишены жгутиков. Типовой вид — Klebsiella pneumonia.

Род Serratia. Название рода связано с именем итальянского физика Серафино Серрати. Они встречаются в почве, воде, на поверхности растений, а также в пищеварительном тракте человека, насекомых и грызунов в качестве комменсалов. У лиц с ослабленной иммунной системой серрации могут вызвать гнойные воспаления самой различной локализации. Типовой вид — Serratia marcescens. Serratia marcescens — это прямые мелкие палочки размером (0,5—0,8) х (0,9—2,0) мкм. Перитрихи при определенных условиях способны образовывать капсулу. Большинство колоний Serratia окрашены в различные оттенки красного цвета за счет образования пигмента продигиозина.

При характеристике БГКП учитываются следующие диффере- ницально-диагностические признаки:

• 1) инкубация посевов при едином температурном режиме — 37°С;
• 2) способность ферментировать лактозу — характер роста на среде Эндо (так называемый лактозный тест). Учитываются колонии темно-красные, с металлическим блеском или без него;
• 3) оксидазный тест: колонии на среде Эндо исследуются на наличие оксидазы. Для дальнейшей идентификации оставляют окси- дазоотрицательные колонии. Колонии с положительным окси- дазным тестом, относящиеся к грамотрицательным бактериям родов Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, не учитываются;
• 4) препараты из характерных колоний окрашивают по Граму — учитываются грамотрицательные палочки;
• 5) бродильная проба на среде Гисса с глюкозой для обнаружения способности бактерий ферментировать глюкозу с образованием кислоты и газа.

Помимо БГКП возбудителями кишечных заболеваний, вызванных употреблением контаминированных пищевых продуктов, могут быть также бактерии родов Morganella и Providencia из семейства Enteribacteriaceae.