Генная инженерия кишечная палочка

Скромная бактерия за полстолетия с момента ее открытия в конце XIX в. стала настоящей волшебной палочкой для молекулярной биологии. Сейчас результаты опытов с ее использованием занимают главы и тома профессиональных и популярных изданий. Конечно, в нашем путеводителе по модельным организмам E. coli должна была занять свое почетное место.

Двенадцать модельных организмов

Привет! Меня зовут Сергей Мошковский. Дорогая редакция «Биомолекулы», выпустив настенный календарь о модельных организмах на 2020 год, заказала было мне лонгрид, который должен был, как суровый конвой, сопровождать календарь на сайте. Минутная слабость — сколько их было в жизни! — и я уже соглашаюсь. Но как писать? Ведь о каждой модельной скотинке, нарисованной на календаре, — как и о нескольких десятках не поместившихся туда, — написаны тома научной и даже популярной литературы. Придется писать не по-журналистски, из головы — как бы не вышло чего-то вроде поэмы «Москва — Петушки», где вместо станций — модельные организмы. Я и еще несколько авторов представляем вам на суд собранье пестрых глав — они будут выходить в течение всего 2020 года. Читатель, прости! Ты знаешь, кого за это винить!

Escherichia и Eschrichtius — Болезнь путешественников — Главная модельная бактерия — Учебник молекулярной генетики — Невезение с CRISPR/Cas

Кишечная палочка — один из первых мемов, с которым сталкиваются дети при знакомстве с биологией (рис. 1а). Запоминающееся, простое и забавное название. Помню, как узнал в детстве, что эта палочка может быть опасной — кто-то мучился животом, а родители сказали, что, наверное, кишечная палочка! Позже, уже в старшей школе, я узнал латинское название этой бактерии, и оно меня удивило, оказавшись каким-то не очень латинским. Оказывается, австрийский педиатр Теодор Эшерих (рис. 1б), который впервые выделил эту палочку из содержимого кишечника в 1885 году, вначале назвал ее благозвучно — Bacterium coli, что означает просто «кишечная бактерия». После ожидаемого пересмотра классификации бактерий род переименовали в честь первооткрывателя. По анекдотическому совпадению очень созвучно — Eschrichtius — называется одно из самых крупных существ на земле — серый кит (рис. 1в). Правда, этого гиганта так назвали в честь другого ученого — датского зоолога Даниэля Эшрихта, работавшего на полвека раньше (рис. 1г). В этом плане другой важной палочке — сенной — повезло больше, поскольку она до сих пор называется Bacillus subtilis, что в переводе — тонкая палочка.

Escherichia

Рисунок 1а. Escherichia длиной 2 мкм

Теодор Эшерих

Рисунок 1б. Теодор Эшерих (1857–1911)

Eschrichtius

Рисунок 1в. Eschrichtius длиной 14 метров

Даниэль Фредрик Эшрихт

Рисунок 1г. Даниэль Фредрик Эшрихт (1798–1863)

Кишечная палочка живет… правильно, в кишечнике человека, составляя по численности не более 0,1% нормальной микрофлоры. Как и многие микроорганизмы, эта грамотрицательная палочка очень изменчива и из дружественного — комменсального — компонента микрофлоры кишечника зачастую превращается во вредный — патогенный. Практически каждый сталкивался с «колийной» инфекцией. Например, именно эшерихия вызывает большинство случаев диареи путешественников. В приморских районах местные жители иммунны к штаммам кишечной палочки, населяющим источники воды, поэтому от них страдают туристы. Одним из параметров качества питьевой воды считается косвенный показатель содержания в ней клеток кишечной палочки — так называемый коли-титр. Как и многие патогенные бактерии, кишечная палочка охотно приобретает свойства множественной устойчивости к антибиотикам . Так, в мире растет число случаев возвратного цистита [1] — воспаления мочевого пузыря — и других инфекций, вызванных мультирезистентными штаммами E. coli.

Зачем же такую опасную бактерию сделали модельной? Дело в том, что в условиях культивирования кишечная палочка часто теряет патогенность, становится неспособной жить в естественных для себя условиях (то есть одомашнивается). И этим свойством в 1940-е годы воспользовались микробиологи, проведя с лабораторными штаммами E. coli (например, со знаменитым штаммом К12) много прорывных для науки экспериментов.

Так, манипулируя мутированными штаммами кишечной палочки, которые уже научились получать при помощи облучения, Джошуа Ледерберг и Эдуард Лаури Тейтем в 1947 году обнаружили способность разных штаммов обмениваться генетическим материалом и спасать друг друга от образовавшихся дефектов, проявлявшихся в неспособности расти на минимальной питательной среде. Так был открыт процесс конъюгации бактерий, который затем послужил важным инструментом для картирования бактериального генома . Ведь тогда это можно было делать только косвенными, микробиологическими методами — сама природа генетического кода была неизвестна.

С начала 1950-х годов исследования по молекулярной генетике с использованием кишечной палочки и ее вирусов в качестве основного инструмента росли как снежный ком. Не будет преувеличением сказать, что к 70-м годам E. coli написала учебник молекулярной генетики! Вспомним открытие генетического кода, в котором участвовало несколько коллективов физиков и молекулярных биологов, в том числе Френсис Крик, Георгий Гамов и другие выдающиеся люди того времени [6]. Основные эксперименты по расшифровке кода велись на бесклеточных лизатах кишечной палочки.

Одновременно (или вскоре после этого) с помощью штаммов эшерихии были заложены основы современной молекулярной биологии. Французы Франсуа Жакоб и Жак Моно на примере лактозного оперона — серии генов E. coli, кодирующих каскад расщепления сахара лактозы, — раскрыли механизмы регуляции генной экспрессии — «самовыражения» генетического материала в виде работы белков, в данном случае — ферментов. На материале кишечной палочки описаны все процессы передачи информации в клетке: так называемые матричные процессы — репликация ДНК, транскрипция и трансляция. Я помню, как в университете на микробиологии нам раздали учебники Стента и Кэлиндара по молекулярной генетике, издания, кажется, 1981 года. Вначале было непонятно, почему это нужно для микробиологии, а потом оказалось, что материал учебника — кстати, очень непростой для восприятия второкурсника — на две трети описывает эксперименты, проведенные на кишечной палочке и ее вирусах.

Позднее обнаружилось, что E. coli хорошо подходит для зародившейся в 1960–1970-е годы биотехнологии [7]. Бактерия хорошо переносит введение в свою клетку гетерологичных (то есть чужеродных) генов и во многих случаях способна синтезировать их продукты без вреда для себя. Белки, полученные таким способом, стали называть рекомбинантными, и теперь они широко используются в медицине и других практических задачах.

Кишечная палочка — возможно, самый исследованный организм с точки зрения молекулярной биологии. Тем не менее у элементов ее генома до сих пор обнаруживают новые свойства. Это одновременно плохо (как же мало мы знаем!) и хорошо (будет чем заняться!). Совсем недавно на защите диссертации я услышал о том, как у одной из генных кассет эшерихии, участвующей в каскаде переработки сульфолипидов, также обнаружена и лактазная активность [8]. До этого такая активность была известна только у знаменитого лактозного оперона Жакоба и Моно, описанного в 1961 году!

Кажется, что E. coli — модельный организм без недостатков. Тем не менее биотехнологам не повезло, что у этой бактерии от природы нет системы бактериального иммунитета CRISPR/Cas [9], о которой я уже упоминал в эссе о бактериофаге лямбда [3]. Именно поэтому эту систему, ныне незаменимую в генной инженерии, открыли относительно поздно.

Кишечная палочка-выручалочка — это здорово (рис. 2). Но теперь пора переместиться в мир ядерных организмов. Удобным инструментом для молекулярной биологии и генетики эукариот оказались одноклеточные грибы — дрожжи — и гаплоидный плесневый гриб — нейроспора. Как они дошли до такой одноклеточной и гаплоидной жизни и что было открыто с их помощью — читайте в следующем материале нашего путеводителя по модельным организмам через месяц.

Кишечная палочка как герой календаря «Биомолекулы»

Рисунок 2. Кишечная палочка Escherichia coli как герой календаря «Биомолекулы». Этот календарь мы сделали в 2019 году и даже провели на него весьма успешный краудфандинг. На тех, кто успел приобрести календарь, палочка уже взирает со стенки, ну а с прочими мы делимся хайрезом этого листа — скачивайте, печатайте и вешайте на стенку! Ну а кто все же хочет приобрести бумажный экземпляр — приглашаем в интернет-магазин «Планеты.ру»!

Благодарность

Автор благодарит своего друга — биоинформатика Анну Казнадзей (ИППИ РАН) за ее увлекательный рассказ о новом «лактозном опероне» кишечной палочки, в открытии которого она участвовала.

Florian Hitzenbichler, Michaela Simon, Thomas Holzmann, Michael Iberer, Markus Zimmermann, et. al.. (2018). Antibiotic resistance in E. coli isolates from patients with urinary tract infections presenting to the emergency department. Infection. 46, 325-331;
Антибиотики и антибиотикорезистентность: от древности до наших дней;
Модельные организмы: фаг лямбда;
12 методов в картинках: генная инженерия. Часть I, историческая;
Молекулярная биология;
У истоков генетического кода: родственные души;
Биотехнология. Генная инженерия;
Anna Kaznadzey, Pavel Shelyakin, Evgeniya Belousova, Aleksandra Eremina, Uliana Shvyreva, et. al.. (2018). The genes of the sulphoquinovose catabolism in Escherichia coli are also associated with a previously unknown pathway of lactose degradation. Sci Rep. 8;
CRISPR-системы: иммунизация прокариот.

Источник

Кишечная палочка (лат. Escherichia coli, E. coli, по имени Теодора Эшериха) – грамотрицательная палочковидная бактерия, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов.E. coli – грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером 0,4-0,8 х 1-3 мкм, объём клетки составляет около 0,6-0,7 мmі. Штаммы, имеющие жгутики, способны передвигаться. Жгутики расположены перитрихально. Протопласт E. coli одет в муреиновый мешок, прилегающий к внешней мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК.

Кишечная палочка может жить на разных субстратах. В анаэробных условиях E. coli образует в качестве продукта жизнедеятельности лактат, сукцинат, этанол, ацетат и углекислый газ. Часто при этом образуется молекулярный водород, который мешает образованию указанных выше метаболитов, поэтому E. coli часто сосуществует с микроорганизмами, потребляющими водород – например, с метаногенами или бактериями, восстанавливающими сульфат.

Оптимальный рост достигается культурами E. coli при температуре 37 °C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49 °C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием, различными парами окислителей и восстановителей, в том числе, окислением пирувата, формиата, водорода, аминокислот, а также восстановлением кислорода, нитрата, диметилсульфоксида и триметиламин N-оксида.

E. coli играет важную роль в современной промышленной микробиологии и биологической инженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli, с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК, находится у истоков современной биотехнологии. Усовершенствование методов получения сферопластов E. coli и их трансфекции позволили достичь достаточно высокой эффективности трансформации молекулами ДНК различных фагов.

Кишечную палочку считают универсальным организмом для синтеза чужеродных белков. В E. coli исследователи вводят гены при помощи плазмид, что позволяет осуществлять биосинтез белков для промышленной ферментации. Также разработаны системы для синтеза в E. coli рекомбинантных белков. Одним из первых примеров использования технологии рекомбинантных ДНК является синтез аналога инсулина человека. Модифицированные E. coli используют при разработке вакцин, синтеза иммобилизованных ферментов и решения других задач. Однако, в организмеE. coli невозможно получать некоторые крупные белковые комплексы, содержащие дисульфидные связи, в частности, белки, для проявления биологической активности которых требуется посттрансляционная модификация.

Чужеродные гены клонируют в так называемых челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом реплицируются в клетках нескольких хозяев, в данном случае, в клетках E. coli. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов этих плазмид.

Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют к ДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации – удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы выделяют из гибридных плазмид, сконструированных специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322, и ген экспрессируется в бактериальной клетке.

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к ампициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз “вшивали” ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и среднего сегмента проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Источник

Генная инженерия кишечная палочка

Двенадцать модельных организмов

Благодарность

Похожие главы из других работ:

2.3 Гідравлічна модель Лоренца

3.1 Модель імплантації у ссавців

2.1 Модель пульсовой волны

Кумулятивная модель

Глава 2. Клетка как основной объект биотехнологических исследований

3.2 Модель 2. Рождаемость и смертность

4.2 Модель 2. Рождаемость и смертность

4.1.2. Модель Большого взрыва

1.1 Модель Лотки-Вольтерра

4. Основные этапы трансформации E. Coli

3. Экономические выгоды производства биотехнологических лекарственных средств

Модель Леметра

Модель де Ситтера

Модель Милна

Модель Фридмана