Кишечная палочка на плоскирева
Среда Плоскирева (именуемая еще бактоагаром Ж) является питательной средой для выращивания некоторых микроорганизмов, в основном шигелл и сальмонелл. Как источник для нее используют инфицированные материалы: мочу, желчь, испражнения.
История
Николай Иванович Плоскирев – советский микробиолог и заслуженный врач РСФСР. Он родился в 1869 и умер в 1948, большую часть жизни проработав в родном городе – Томске.
В 1888 году он, будущий ученый, не окончив шестой класс школы, поступил на военную службу. Закончить обучение он смог только 1892 году, после чего сдал экзамены на поступление в Императорский Томский университет, учился на медицинском факультете. В 1898 году получил звание лекаря.
Плоскирев участвовал в русско-японской войне, а после нее работал в томском госпитале. В 1910 году назначен на пост руководителя томской кожно-венерологической больницы и в течение тридцати лет был ее бессменным главой. Так же ученый являлся одним из учредителей кожно-венерологического диспансера в Томске.
Николай Иванович Плоскирев написал целую серию работ, посвященных борьбе с венерологическими заболеваниями.
Состав
Среда Плоскирева – материал для культивирования кишечных бактерий, а значит, должна содержать несколько видов питательных веществ. Выпускается она в сухом виде.
Довольно большую долю в ее общей массе имеет панкреатический гидролизат кильки (10,4 г/л). Чуть меньше приходится на двузамещенный гидроцитрат натрия (8,5 г/л). Также здесь содержится сухой питательный бульон и молочный сахар (8,62 и 7,3 г/л).
Второе название среды Плоскирева – бактоагар Ж. В составе его присутствует агар в количестве 6,94 г/л. Содержание безводного сериоватистокислого натрия равно 5,1 г/л. Имеется наличие обезвоженного фосфата динатрия – 2,1 г/л, натриевых солей желчных кислот около 3,46 г/л, а кальцинированной соды – 2,4 г.
Менее грамма содержится в ней индикаторов – нейтрального красного (0,05) и бриллиантового зеленого (0,0002). Содержание йода – 0,13.
Применение
Изучение биохимических процессов бактерий играет очень важную роль в диагностике заболеваний, которые вызывают анаэробные организмы. Видов, входящих в это семейство, – сотни. Они практически идентичны в морфологии и культуральных свойствах, и самый надежный способ отличить их друг от друга – это изучение биохимии.
Исследование начинается с засевания патологического материала в питательную среду. Она дифференциально-патологическая для кишечной группы бактерий, и в состав ее, помимо мясопептонного агара, входят индикатор и лактоза. Способность переработки лактозы – важный признак дифференциации энтеробактерий. Если это обнаруживается, то pH смещается в сторону кислотности и срабатывает индикатор, который окрашивает колонию.
В других странах могут использоваться другие питательные среды, но механизм их действия соответствует трем наиболее распространенным в России – это среды Эндо, Левина и среда Плоскирева.
Описание метода
За рубежом аналогом среды Плоскирева является так называемый MacConkey Agar. В готовом виде раствор прозрачен, имеет легкий розовато-желтый оттенок. Колонии, способные перерабатывать лактозу, в среде Плоскирева дают красный (брусничный) цвет. Если же бактерия не может перерабатывать ее, колония либо бесцветна либо имеет слабый окрас.
Ввиду того что в состав среды Плоскирева входят вещества-ингибиторы (бриллиантовый зеленый, желчные соли, йод), она фактически полностью подавляет рост грамположительной флоры, а в первые сутки значительно задерживает рост эшехирий, а так же другой обычно сопутствующей микрофлоры.
Второй этап
Далее происходит отбор интересующей колонии, и она засевается на среды первичной дифференциации и накопления. Среды, на которых происходит засев, должны содержать несколько субстратов. Бактериальная культура должна обнаружить ферментативную активность по отношению к ним, к тому же среды располагаются в пробирках так, чтобы было два участка:
- тот, на котором агар скошен;
- со столбиком.
Интересующая исследователя колония заселяется на скошенную часть плотным штрихом, а в столбик – уколом. На этом этапе используются среды Рессела, Клиглера или Олькеницкого. Как дифференциально-диагностическая используется и среда Плоскирева.
Микробиология и патогенные организмы
Агар Плоскирева является важным фактором в выявлении инфекций, вызываемых энтеробактериями. Так, например, на ней выращивают и дифференцируют колонии микроорганизмов, являющихся возбудителями бактериальной дизентерии. Это анаэробные организмы, входящие в род Schigella.
Подобно всем, кто является частью семейства кишечных бактерий, шигеллы имеют вид палочек, размером два микрометра. Они не образовывают капсул и спор, не имеют жгутиков – это позволяет их отличать от сальмонелл, которые, в свою очередь, подвижны. Они отлично растут на самых простых средах, при температуре чуть выше комнатной (35-37°С) и 7,4 pH. По характеру роста, колонии не отличаются от сальмонелл.
Как говорилось выше, микроорганизмы могут практически не иметь морфологических различий, однако существенно различаться в биохимических процессах жизнедеятельности. Так, исключая шигеллы Ньюкестл, при ферментации углеводов происходит образование кислоты без газа. За исключением шигелл Зонне, они не могут ферментировать лактозу, но расщепляют глюкозу. Так же к их ключевым особенностям можно отнеси то, что они могут редуцировать нираты в нитриты. Их колонии не расщепляют мочевину, а так же в питательной среде не происходит разжижения желатина.
Сбор и подготовка посевного материала
Чтобы обнаружить возбудителей дизентерии, необходимы микробиологические исследования зараженных сред, то есть испражнений больного. После получения материала, необходимо как можно быстрее делать посев. Если это невозможно, источник нужно поместить в консервирующее вещество – фосфатную буферную смесь или глицерин. При температуре 4°С они могут храниться не более суток. Сбор материала необходимо производить при помощи ректальной стеклянной трубки, которая вводится в прямую кишку.
Для исследования из материала выбираются гнойно-слизистые кусочки, которые должны быть промыты в двух-трех пробирках изотонического раствора хлорида натрия.
Нанесение патогенных бактерий на среду Плоскирева производится стеклянным шпателем. Необходимо на небольшом участке втереть его в агар, потом оторвать шпатель от среды, а остаточный материал втереть в незасеянную поверхность. Если посев делается в несколько чашек, то в каждую из них нужно засевать новую порцию.
Если слизисто-гнойных кусочков нет во взятых на анализ выделениях, это еще не значит, что там не присутствуют патогенные микроорганизмы. В таком случае необходимо эмульгировать фекалии в 10 мл раствора хлорида натрия (концентрация 0,85%), затем засеять одну или две капли на среду Плоскирева. Неэмульгированный стул можно засевать в селенитовый бульон. Он же используется, если вместо фекалий имеются рвотные массы или промывные воды.
Микробиологическая диагностика
На первом этапе микробиологического исследования проводится засев патогенных бактерий в две чашки, чтобы затем наблюдать, как растут шигеллы. На среде Плоскирева производится один посев, второй же – на среде Левина или Эндо.
Ввиду того что появились штаммы шигелл, устойчивые к антибиотикам, к средам добавляется левомицетин. Затем в течение суток происходит инкубация в термостате при температуре 37°С.
На второй день нужно изучить выросшие колонии. Те, что не на дифференциально-диагностической среде выросли бесцветными, необходимо отсеять на среду Ресселя или короткий “пестрый ряд”. Далее исследование проводится по алгоритму первичных посевов на них. Колонии шигелл на среде Плоскирева растут в виде прозрачных, бесцветных и мелких колонн. Они бывают двух видов:
- приплюснутые с зазубренными краями;
- округлые, выпуклые, с характерным влажным блеском.
Три-четыре колонии необходимо микроскопировать и исследовать на подвижность. В случае, если последней не обнаруживается, их переселяют на среду Олькеницкого, чтобы выделить чистую культуру. При отсутствии характерных колоний шигелл или если не наблюдается вообще никакого роста, необходимо на агар Эндо или Плоскирева производить высев из селенитового бульона. Если типичные колонии присутствуют в достаточном количестве, ставится ориентировочная реакция агглютинации. Используется смесь сывороток Зонне и Флекснера, реакция проходит на стекле.
Дальнейшее исследование
В третий день отмечаются изменения, произошедшие в колониях на среде Ресселя. Если есть культура, которая не разлагает лактозу, а глюкозу сбраживает с образованием кислоты, ее отделяют и исследуют, проводят микроскопию, а также проводят посев на “пестрый ряд”, однако на этот раз развернутый. Так же ставится реакция агглютинации, в целях серологической идентификации.
В последний день можно сделать заключение на основании изменений в “пестром ряду” (происходит ли ферментация углеводов), а так же подводятся итоги реакции агглютинации.
Хранение и приготовление
Приготовление агара Плоскирева происходит таким образом:
- 55 г сухого вещества размешивают в литре дистиллированной воды.
- Кипятят в течение двух-трех минут, до тех пор, пока агар полностью не расплавится.
- Разливают в чашки Петри (стерильность необязательна) слоем в 5-6 мм.
- Чашки оставляют открытыми на полтора часа при комнатной температура (18-25 градусов). По истечении этого времени среда достаточно застынет и подсушится.
Среда Плоскирева светочувствительная и гигроскопична. Порошок необходимо хранить в герметичной упаковке, относительная влажность воздуха в помещении не должна превышать 60%. Оптимальная температура для хранения от 2°С до 25°С. Необходимо соблюдать приведенные правила хранения, в ином случае возможны неточные результаты исследований.
Источник
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
(для просмотра изображений в полном размере, щелкните по ним правой кнопкой мыши и выберите пункт “ОТКРЫТЬ ИЗОБРАЖЕНИЕ В НОВОЙ ВКЛАДКЕ”)
ПИТАТЕЛЬНЫЙ АГАР используют для выращивания бактерий, содержит гидролизат кильки, экстракт дрожжей, агар, хлорид натрия и дистиллированную воду. Растворяют ингредиенты, кипятят, фильтруют, стерилизуют (120 гр. С 20 минут). Затем разливают в стерильные пробирки или чашки Петри. На чашке с агаром видны разнообразные колонии микробов, выросшие в при посеве воздуха.
СМЕСЬ БАКТЕРИЙ
На чашке с МПА видны различные колонии бактерий, отличающиеся по цвету, форме, размерам, прозрачности…. Культуральные свойства Escherichia coli: круглые с ровными краями, гладкие, влажные, слизистые, полупрозрачные колонии.
ЖЕЛТОЧНО-СОЛЕВОЙ АГАР ЧИСТОВИЧА – селективная среда, предназначенная для культивирования стафилококков. Содержит питательный агар, желток куриного яйца, повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков и обеспечивают элективность среды для данных микробов. Среда позволяет дифференцировать лецитиназопозитивные стафилококки, вокруг колоний которых образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком.
КРОВЯНОЙ АГАР питательная среда для выявления гемолитических свойств бактерий. К расплавленному остуженному (до 45-50 гр С) питательному агару асептически добавляют 5-10% дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри. Вокруг выросших колоний отчетливо видны прозрачные зоны гемолиза.
СРЕДА ПЛОСКИРЕВА – дифференциально-диагностическая и селективная, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка и пр.). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Лактозонегативные колонии вырастают бесцветными, лактозопозитивные – красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют.
СРЕДА ЭНДО предназначена для выделения энтеробактерий, обнаружения эшерихий. Состоит из питательного агара, 1% лактозы и индикатора – основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные кишечные палочки образуют бесцветные колонии.
СРЕДА ОЛЬКЕНИЦКОГО (ТРЕХСАХРНЫЙ АГАР) предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности сбраживать углеводы в присутствии индикатора.
Рост на трехсахарном железосодержащем агаре:
1. Контроль (незасеянная среда)
2. Salmonella серовара Typhimurium
3. Escherichia coli
4. Shigella flexneri
5. Salmonella серовара Typhi
Пептический перевар животной ткани, гидролизат казеина, дрожжевой и мясной экстракты являются источником азотистых веществ, серы, микроэлементов, витаминов группы В и др. Лактоза, сахароза и глюкоза – ферментируемые субстраты. Тиосульфат натрия в сочетании с ионами железа являются индикатором на сероводород, феноловый красный – индикатор рН.
Микроорганизмы, ферментирующие глюкозу, способствуют образованию многих кислот, изменяющих цвет среды с красного на желтый. Большее количество кислот освобождается в столбике (при ферментации), по сравнению со скошенной частью (окисление). Бактерии образуют также щелочные продукты (в ходе окислительного декарбоксилирования пептона). Принципиальное значение имеет соотношение глюкоза/лактоза(сахароза) = 1:10. Индикатор феноловый красный становится желтым при значениях рН менее 6,8. При исходном значении рН=7,4 требуется относительно небольшое количество кислот для развития желтого окрашивания среды. Щелочные продукты могут нейтрализовать небольшое количество кислоты, образуемое в скошенной части при ферментации глюкозы. Таким образом, щелочной (красный) скос и кислый (желтый) столбик указывают, что микроорганизм ферментирует глюкозу, но не ферментирует лактозу и/или сахарозу. Бактерии, ферментирующие помимо глюкозы лактозу и/или сахарозу, образуют большое количество кислот, которое не может быть нейтрализовано аминами, поэтому скос и столбик будут кислыми (желтыми). Если в ходе ферментации образуется газ, его можно определить по пузырькам и характерным разрывам среды. Некоторые виды бактерий восстанавливают тиосульфат до сероводорода, который, взаимодействуя с ионами железа, образует нерастворимый черный преципитат сульфида железа. Восстановление тиосульфата происходит только в кислой среде и почернение обычно бывает в зоне столбика.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ МЕТОД ДИСКОВ
Бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 0 С в течение суток. По диаметру зон задержки роста культуры судят о ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста до 15 мм культура расценивается как нечувствительная или низко чувствительная, 15 – 24 мм – средняя чувствительность, 25 мм и более – высокочувствительная.
СРЕДА ВИЛЬСОНА-БЛЕРА
(ЖЕЛЕЗО-СУЛЬФИТНЫЙ АГАР) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозы, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробные клостридии (Clostridium perfringens) образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой.
ВИСМУТ-СУЛЬФИТНЫЙ АГАР селективная среда для выделения сальмонелл. Готовая среда непрозрачна, зеленоватого цвета. Содержит глюкозу, неорганические соли, бриллиантовый зеленый, питательный агар. Бриллиантовый зеленый и висмут подавляют рост грамположительной флоры и многих энтеробактерий, в том числе шигелл, эшерихий. Сальмонеллы при росте на среде выделяют сероводород, который взаимодействует с солями висмута. В результате образуются колонии черного цвета с металлическим оттенком на зеленоватом фоне среды.
СРЕДЫ ГИССА дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий (кишечной группы). Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет . В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.
СРЕДА КИТТА-ТАРОЦЦИ обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Ее используют для культивирования и хранения клостридий. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды.
ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ОТТО (МЕТОД СТЕКАЮЩЕЙ КАПЛИ)
На чашку с МПА шпателем выполняется посев суточной бульонной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.
ФАГОТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФИШЕРА
Испытуемую суточную бульонную культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага.
СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АЭРОБОВ И АНАЭРОБОВ (МЕТОД ФОРТНЕРА)
В чашке с сахарным агаром вырезается «траншея» («ров») для невозможности миграции, смешивания разных культур бактерий. С одной стороны выполняется посев культуры аэробных бактерий, с другой – умеренно строгих анаэробов. Чашка закрывается, ее края запаиваются парафином (с целью не допустить попадания воздуха, кислорода внутрь чашки). Сначала вырастают в присутствии кислорода аэробы, а затем – анаэробы.
ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФЮРТА
В расплавленный и остуженный МПА (45-50 гр. С) добавляют определенный бактериофаг и выливают в чашку Петри. Чашка с полученным агаром делится на несколько секторов, в каждый из которых засеваются неизвестные культуры, выделенные от больных. Там, где культура соответствует бактериофагу, наблюдается отсутствие роста (лизис) бактерий.
ТИТРОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГА ПО МЕТОДУ ГРАЦИА
1,0 мл фага смешивают в пробирке с 0,5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПА. Все содержимое выливают в чашку с МПА. Дают застыть верхнему тонкому слою и ставят в термостат. При встрече фага с бактерией, происходит лизис последней и образуется негативная колония фага. Такие негативные колонии затем подсчитывают для определения титра. Титром фага называют количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага.
ОПЫТ ВЫЯВЛЕНИЯ ФИТОНЦИДОВ ЧЕСНОКА
Чашку с МПА равномерно засевают шпателем суточной бульонной культурой бактерий (например, стафилококка). В центр посева помещают дольку чеснока, предварительно измельченного. Инкубируют в термостате. Через сутки отчетливо видна зона отсутствия роста вокруг измельченного чеснока (стерильная зона).
Источник