Кишечная палочка объект биотехнологии

Кишечная палочка (лат. Escherichia coli, E. coli, по имени Теодора Эшериха) – грамотрицательная палочковидная бактерия, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов.E. coli – грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером 0,4-0,8 х 1-3 мкм, объём клетки составляет около 0,6-0,7 мmі. Штаммы, имеющие жгутики, способны передвигаться. Жгутики расположены перитрихально. Протопласт E. coli одет в муреиновый мешок, прилегающий к внешней мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК.

Кишечная палочка может жить на разных субстратах. В анаэробных условиях E. coli образует в качестве продукта жизнедеятельности лактат, сукцинат, этанол, ацетат и углекислый газ. Часто при этом образуется молекулярный водород, который мешает образованию указанных выше метаболитов, поэтому E. coli часто сосуществует с микроорганизмами, потребляющими водород – например, с метаногенами или бактериями, восстанавливающими сульфат.

Оптимальный рост достигается культурами E. coli при температуре 37 °C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49 °C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием, различными парами окислителей и восстановителей, в том числе, окислением пирувата, формиата, водорода, аминокислот, а также восстановлением кислорода, нитрата, диметилсульфоксида и триметиламин N-оксида.

E. coli играет важную роль в современной промышленной микробиологии и биологической инженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli, с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК, находится у истоков современной биотехнологии. Усовершенствование методов получения сферопластов E. coli и их трансфекции позволили достичь достаточно высокой эффективности трансформации молекулами ДНК различных фагов.

Кишечную палочку считают универсальным организмом для синтеза чужеродных белков. В E. coli исследователи вводят гены при помощи плазмид, что позволяет осуществлять биосинтез белков для промышленной ферментации. Также разработаны системы для синтеза в E. coli рекомбинантных белков. Одним из первых примеров использования технологии рекомбинантных ДНК является синтез аналога инсулина человека. Модифицированные E. coli используют при разработке вакцин, синтеза иммобилизованных ферментов и решения других задач. Однако, в организмеE. coli невозможно получать некоторые крупные белковые комплексы, содержащие дисульфидные связи, в частности, белки, для проявления биологической активности которых требуется посттрансляционная модификация.

Чужеродные гены клонируют в так называемых челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом реплицируются в клетках нескольких хозяев, в данном случае, в клетках E. coli. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов этих плазмид.

Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют к ДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации – удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы выделяют из гибридных плазмид, сконструированных специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322, и ген экспрессируется в бактериальной клетке.

Однако удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

В качестве примера маркирования вектора могут служит первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к ампициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз “вшивали” ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и среднего сегмента проинсулина.

С другой стороны, если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику.

Источник

ESCHERICHIA COLI КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ В БИОЛОГИИ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЕ

Авторы
Файлы работы
Сертификаты

Кайсаров И.Д. 1, Борейко А.С. 1, Николаев В.А. 1, Казакова М.С. 1, Поляков Н.К. 1

1Волгоградский государственный медицинский университет

Комментарии

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке “Файлы работы” в формате PDF

Кишечная палочка (лат. Escherichia coli) — вид грамотрицательных факультативно-анаэробных подвижных палочковидных бактерий. E. coli является обитателем нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека.

Вид кишечная палочка (лат. E. coli) включён в род эшерихии (лат. Escherichia), семейство энтеробактерии (лат. Enterobacteriaceae), порядок энтеробактерии (лат. Enterobacteriales), класс гамма-протеобактерии (лат. γ-proteobacteria), тип протеобактерии (лат. Proteobacteria), царство бактерии. (Гусев М.В., Минеева Л.А., “Микробиология” 2003)

Развитие методов молекулярной биологии и генетики, направленных на изучение механизмов наследственности и изменчивости живых организмов, вызвало потребность в подходящих для решения таких задач модельных объектах. Все объекты генетических исследований, служащие моделями для изучения основных закономерностей наследственности и изменчивости, должны отвечать определённым требованиям: доступность; простота культивирования; высокая интенсивность роста клеточной культуры; короткий репродуктивный период. Среди прокариотов всем этим требованиям лучше всех отвечает кишечная палочка, что делает данный вид бактерий классическим объектом для молекулярно-генетических исследований. (Коничев А.С., Севастьянова Г.А. “Молекулярная биология” 2005)

Изучение E. coli также сыграло важную роль в развитии современной промышленной микробиологии и биоинженерии. Работа Стенли Нормана Коэна и Герберта Бойера на E. coli, с использованием плазмид и эндонуклеаз рестрикции для создания рекомбинантной ДНК, стала одной из фундаментальных для современной биотехнологии. Впервые технология рекомбинантных ДНК была успешно применена с целью синтеза аналога инсулина человека колонией кишечной палочки. (Тимощенко Л.В., Чубик М.В., “Основы микробиологии и биотехнологии” 2009)

Большой интерес к E. coli как к модельному объекту возник в конце XX столетия и поддерживается в настоящее время по причине незаменимости данного вида бактерий в широком спектре исследований. На сегодняшний день E. coli является одним из наиболее часто использующихся биообъектов научных и клинических исследований. Модифицированные штаммы E. coli используются при разработке вакцин, синтеза биологически активных веществ, и решения других задач. (Бирюков В.В. “Основы промышленной биотехнологии” 2004)

Список литературы:

Гусев М.В., Минеева Л.А., Микробиология, 4-е изд., стер. – М.: Академия, 2003. — 464 с.
Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Молекулярная биология, М.: Издательский центр “Академия”, 2-е изд., 2005. – 400 с.
Тимощенко Л.В., Чубик М.В., Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.
Бирюков В.В., Основы промышленной биотехнологии, Издательство: «КолосС», 2004.- 296 с.

Просмотров работы: 717

Код для цитирования:

Источник

Escherichia coli – кишечная палочка – в основном безвредная бактерия, являющаяся частью физиологической кишечной флоры людей и животных. К сожалению, некоторые виды бактерий способны вызывать заболевания.

Обычно это желудочно-кишечные инфекции, проявляющиеся как диарея, инфекции мочевыводящих путей или менингит. При благоприятных условиях кишечная палочка может вызывать инфекцию других органов, в том числе желчных протоков или дыхательной системы.

Это также наиболее распространенный этиологический фактор при внутрибольничных инфекциях. Escherichia coli часто поражает людей с тяжелыми сопутствующими заболеваниями, в том числе с сахарным диабетом, алкоголизмом, хронической обструктивной болезнью легких.

Кишечная палочка также является маркером загрязнения питьевой воды путем выявления так называемых титров Escherichia coli. Штаммы, вызывающие диарею, передаются через загрязненную воду, пищу или через прямой контакт с инфицированными людьми или животными. Escherichia coli также является наиболее распространенным этиологическим фактором диареи путешественников.

Escherichia coli

Патогенные кишечные палочки

Среди штаммов Escherichia coli были выделены следующие: патогенные кишечные палочки, которые могут вызывать тяжелые инфекции:

Entero Escherichia coli (Enterohemorrhagic E. coli – EHEC). Иначе: Escherichia coli, продуцирующая токсин Shiga (анг. Shiga toxin, STEC ) или Escherichia coli, продуцирующая werocytotoksynę (анг. Verocytotoxin, VTEC ). Наиболее известная и самая распространенная бактерия в этой группе – Escherichia coli O157: H7. Энтерогеморрагические штаммы кишечной палочки встречаются в пищеварительном тракте жвачных животных (КРС, козы, овцы, олени, лоси), свиней и птиц. Все они могут распространять бактерии. Наиболее распространенные источники заражения людей – крупный рогатый скот, употребление загрязненной воды, сырое или недоваренное мясо, непастеризованное молоко или молочные продукты, прямой контакт с животными или фекалиями больных людей, например, при смене подгузников.
Энтеротоксигенная кишечная палочка (Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC). Является основной причиной «диареи путешественников». Вырабатывает энтеротоксин, поражающий клетки слизистой оболочки тонкого кишечника, вызывая выделение большого количества воды в просвет кишечника.
Энтеропатогенная кишечная палочка (Enteropathogenic Escherichia coli – EPEC) Распространенный этиологический агент диареи у детей.
Enteroagregacyjna Escherichia coli (Enteroaggregative Escherichia coli – EAggEC). Вызывает хроническую диарею у детей в развивающихся странах. Это также этиологический фактор в 30% случаев «диареи путешественников». В 2011 году мутант этого штамма, способный продуцировать токсин шига – O104: H4, вызвал эпидемию в Германии. У 22% из зараженных развился гемолитический уремический синдром. Источником бактерий оказались семена пажитника, импортированные из Египта.
Enteroinwazyjna Escherichia coli (Enteroinvasive Escherichia coli – EIEC). Вызывает бактериальную дизентерию.
Adherencyjna Escherichia coli (Диффузно адгезивная Escherichia coli – DAEC). Вызывает хроническую диарею у детей.
Штаммы Escherichia coli, содержащие антиген K1. Вызывают менингит у новорожденных. Инфекция у взрослых обычно является осложнением нейрохирургических операций или повреждений центральной нервной системы.
Уропатогенная кишечная палочка. Этиологический фактор инфекции мочевыводящих путей, пиелонефрита, острого простатита, а также инфекции крови в виде уросепсиса. Бактерии, принадлежащие к этому штамму, имеют особенность, позволяяющую им соединяться с клетками, выстилающими мочевыводящие пути. Инфекция мочевого пузыря особенно распространена у взрослых женщин. Также увеличивает риск инфекции наличие гипертрофии простаты или катетера мочевого пузыря.

Как часто возникают инфекции толстой кишки

Данные по странам различаются, но тенденция к увеличению таких инфекций сохраняется.

Например, по данным Национального института гигиены, в Польше ежегодно насчитывается около 400-500 диарей-формирующих инфекций Escherichia coli, несколько случаев энтерогоррагических инфекций Escherichia coli и несколько случаев гемолитического уремического синдрома А в Соединенных Штатах ежегодно диагностируется более 260000 случаев энтерогеморрагической инфекции кишечной палочки, включая 36% штамма O157: H7, который вызывает серьезные осложнения.

В каждой европейской стране ежегодно обнаруживается несколько десятков случаев менингита и сепсиса, вызванных штаммом K1 Escherichia coli. По оценкам специалистов, около 50% женщин испытывают по крайней мере один эпизод инфекции мочевыводящих путей, вызванной уропатогенной кишечной палочкой. Это также ведущий этиологический фактор при внутрибольничных инфекциях.

Частота возникновения других инфекций, вызванных кишечной палочкой, неизвестна, поскольку отдельная статистика по ним практически не ведется.

Как проявляются инфекции, связанные с кишечной палочкой

Симптомы заражения энтерогеморрагической кишечной палочкой:

Инкубационный период заболевания составляет от 1 до 10 дней, обычно 3-4 дня. Первым симптомом является диарея, часто с примесью свежей крови, спазмы в животе, рвота, умеренная температура. Симптомы длятся в среднем 5-7 дней.
У 5-10% пациентов, обычно через 7 дней, когда проходит диарея, развивается опасное для жизни осложнение, т.е. гемолитический уремический синдром, включающий повреждение почек, проявляющийся как уменьшение или прекращение мочеиспускания и разрушение эритроцитов, приводящее к анемии, проявляющаяся бледной кожей и общей слабостью.

Диарея

Симптомы заражения Escherichia coli, продуцирующей токсин шига – штамм, выделенный во время эпидемии в Германии в 2011 году, сходные с симптомами, связанными с энтерогеморрагической инфекцией. Однако чаще наблюдается развитие гемолитического уремического синдрома, который дополнительно сопровождается неврологическими симптомами, которые не обнаруживаются при энтерогеморрагической инфекции.

Симптомы кишечной coli- индуцированной дизентерии, вызванной энтеро-инвазивной кишечной палочкой:

кровавый понос;
лихорадка;
спазмы в животе;
боль и давление на кишечник при дефекации.

Симптомы диареи путешественников, обычно вызываемой энтеротоксиногенной или энтероагрегационной кишечной палочкой:

инкубационный период составляет 1-2 дня;
стул водянистый, обычно не содержит патологических примесей, таких как кровь или слизь;
сопровождается спастическими болями в животе;
признаки обезвоживания: сухость слизистых оболочек, общая слабость, усиление жажды.

Усиление жажды

Симптомы обычно длятся 3-4 дня и проходят самостоятельно.

Симптомы детской диареи, вызванной EAggEC, EAEC, EPEC:

стул водянистый, без патологических примесей, таких как кровь или слизь;
диарея длится до 2 недель и более;
иногда лихорадка.

Инфекция мочевых путей уропатогенными штаммами кишечной палочки вызывает так называемые дизурические симптомы:

учащенное мочеиспускание;
срочность мочеиспускания;
уретральное жжение.

В запущенных случаях нелеченных инфекций может развиться пиелонефрит, что проявляется, среди прочего, высокой температурой, ознобом, болью в пояснице, тошнотой или рвотой.

Острый простатит также возникает с высокой температурой, ознобом, болью в нижней части живота, а также с болезненностью, отеком и повышением температуры в области простаты.

Симптомы физиологической инфекции Escherichia coli:

Пневмония. Обычно поражает нижние доли и может быть осложнена эмпиемой. Симптомы пневмонии: повышение температуры, одышка, учащенное дыхание. При физикальном обследовании выявляются аускультация и приглушенный звук во время постукивания во время аускультации легких.
Перитонит. Типичное осложнение, которое возникает после разрыва или дивертикула придатка – перитонит. Основные симптомы: лихорадка, сильные боли в животе, а также остановка газов и стула. Физикальное обследование показывает перитонеальные симптомы, в том числе симптом Блюмберга, больной лежит характерным образом – с согнутыми ногами, мышцы живота очень напряжены.
Заболевания желчного пузыря. Симптомы острого холангита и холецистита: лихорадка с ознобом, боль в животе в правом подреберье и желтуха – симптомы, которые образуют так называемые Триаду Шарко.

Штаммы Escherichia coli, содержащие антиген K1, могут проявляться менингитом у новорожденных, в том числе лихорадкой, желтухой, снижением аппетита, апноэ, рвотой, сонливостью, судорогами. У детей старше 4 месяцев также может возникнуть ригидность затылочных мышц, то есть невозможность пассивного изгиба головы к груди.

Если вы заметили симптомы, описанные выше, обратитесь к врачу.

Как врач определяет диагноз?

Диагностика инфекции Escherichia coli возможна с помощью посева микробиологической культуры или прямого исследования биологического материала, например, фекалий, мочи, крови, мокроты, спинномозговой жидкости, аспирата. Можно идентифицировать штамм, который вызывает инфекцию, а также обнаружить токсины шига.

В зависимости от штамма и места заражения дополнительные анализы показывают наличие лейкоцитов в кале, моче, спинномозговой жидкости, высокие значения воспалительных параметров: С-реактивный белок, прокальцитонин, фибриноген. Для диагностики пневмонии назначается рентген легких, а компьютерная томография для внутрибрюшных инфекций.

Рентген легких

Методы лечения инфекционных заболеваний, связанных с кишечной палочкой

Основой для лечения диареи, вызванной инфекцией кишечной палочки – гидратация организма.

Применение антибиотиков, как правило, не является необходимым. Более того, антибиотики противопоказаны при лечении штаммов, продуцирующих токсины шига, в связи с повышенным риском развития гемолитического уремического синдрома. Также увеличивают этот риск противодиарейные препараты, блокирующие перистальтику кишечника, такие как лоперамид.

Инфекции, вызванные другими штаммами кишечной палочки, требуют антибиотикотерапии. Иногда необходимо хирургическое лечение, дренирование абсцесса или искусственная вентиляция легких с помощью респиратора.

Искусственная вентиляция легких с помощью респиратора

Можно ли полностью вылечить инфекции, вызванные кишечной палочкой?

Прогноз полного выздоровления зависит от вовлеченных органов, серьезности инфекции и времени, когда было начато лечение.

В некоторых случаях кишечная палочка выделяется из фекалий здоровых людей даже через несколько недель после исчезновения симптомов. У детей период носительства обычно длится дольше, чем у взрослых.

Гемолитический уремический синдром, осложняющий инфицирование штаммами, продуцирующими токсин шига, связан со смертностью в 2-3% случаев, в то время как неонатальная септицемия, вызванная штаммом Escherichia coli K1, связана с 8%-ным риском смерти.

Что делать после прекращения лечения кишечной палочки?

Пациентам с менингитом может потребоваться реабилитация и последующее наблюдение для выявления неврологических дефектов. Лечение после других инфекций рассматривается индивидуально.

Что делать, чтобы избежать инфекций кишечной палочки?

Чтобы избежать энтерогеморрагической инфекции кишечной палочки, тщательно мойте руки после посещения туалета, смены подгузников, перед приготовлением пищи, после контакта с животными.

Готовьте мясо таким образом, чтобы оно было полностью проварено;
Избегайте сырого непастеризованного молока и молочных продуктов;
Также не употребляйте непастеризованные соки;
Избегайте глотания воды при плавании в озерах, прудах, бассейнах.

Рекомендации по профилактике «диареи путешественников» включают:

Соблюдение гигиены, в том числе частое мытье рук с мылом или использование спиртовых средств, особенно перед едой;
Питье только бутилированной, кипяченой или химически очищенной воды, без использования водопроводной воды и льда, приготовленного из воды неизвестного происхождения;
Использование бутилированной, кипяченой или химически очищенной воды для мытья посуды, полоскания рта, мытья фруктов и овощей, приготовления еды и кубиков льда;
Употребление продуктов в фирменной упаковке или свежеприготовленных в горячем виде.
Не есть сырое мясо и морепродукты, а также неочищенные фрукты и овощи.

Поделиться ссылкой:

Источник