Кишечную палочку используют для экспрессии чужеродных генов
Time:2017-08-15 оригинал публикации
В биомедицинских и других направлениях исследований наблюдается растущая потребность в рекомбинантных белках. Чтобы получить рекомбинантный белок кодирующая протеин последовательность клонируется в вектор экспрессии и далее трансформируется в клетке-хозяине. Что же такое вектор экспрессии? Упрощенно, вектор экспрессии – это молекула ДНК, приносящая специфический ген в клетку-хозяина и использующая систему синтеза белков этой клетки для синтеза закодированного этим специфическим геном белка. Векторы экспрессии включают экспрессию чужеродных генов в клетке-хозяине на высоком уровне. После нескольких лет развития использование векторов экспрессии стало широко применяемой популярной биотехнологией.
В связи со своей функцией вектор экспрессии может содержать элементы, необходимые для экспрессии генов. Хорошо известные элементы включают в себя нормальный или сильный промоутер, правильную инициирующую трансляционную последовательность, такую как рибосомальный связывающий сайт и инициирующий кодон, терминальный кодон, транскрипционная терминальная последовательность. Дополнительно, для того чтобы облегчить очищение протеина после его продукции, векторы экспрессии обычно имеют метку очищения, которая добавлена к последовательности интересующего протеина. Наконец, некоторые векторы экспрессии имеют определенные элементы, имеющие решающее значение для процессов трансформации или трансфекции.
Обычно вектор экспрессии более сложный по сравнению с вектором клонирования – молекула ДНК, которая несет чужеродную ДНК в клетку-хозяина, внутри клетки реплицирует и продуцирует множество копий гена-мишени. Векторы клонирования содержат элементы, важные для саморепликации, но не имеют элементов, контролирующих экспрессию белков. В сравнение, векторы экспрессии имеют оба эти элемента.
В настоящее время доступен ряд систем экспрессии белков, таких как E. coli, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих. Соответственно, существует множество различных векторов экспрессии, которые могут использоваться в различных системах экспрессии. Наиболее часто используемые векторы экспрессии – это плазмиды или вирусы. Какой выбрать вектор экспрессии, зависит от системы экспрессии и множества других факторов. Подходящий вектор экспрессии усиливает успешную экспрессию белка-мишени и, если это необходимо, очистку белка.
Выбирая вектор экспрессии, примите во внимание следующие моменты:
Система экспрессии
Необходимо выбрать вектор, соответствующий системе экспрессии (такой, как дрожжи, E. coli, клетки млекопитающих, насекомых, etc.).
Перед выбором вектора необходимо выбрать систему экспрессии для интересующего протеина.
Pic. 1 Показан вектор экспрессии pET22b-JT, использующийся в системе экспрессии E. Coli
Pic. 2 Показан вектор экспрессии pPic9k-JT использующийся в системе экспрессии E. Coli
Метка очистки
Если вы хотите очистить белок после экспрессии, вектор экспрессии может содержать метки экспрессии, такие как His, Myc, FLAG, etc. В дополнение, присутствие C-terminal или N-terminal зависит от специфических условий эксперимента.
Использование белка
Векторы экспрессии могут содержать другие метки и химерные последовательности, в соответствии с целями последующего использования белка-мишени. Если необходимо лучше понять функцию белка-мишени, метки и другие последовательности – полезный инструмент, позволяющие в дальнейшем проводить вестерн блот, иммунопреципитацию и другие эксперименты.
Сила промотора
В некоторых случаях необходим сильный промотор, в других – нормальный промотор. Например, в дрожжах TEF1 – сильный структурный промотор, ADH1 структурный промотор средней силы, STE1 – слабый структурный промотор. Идеальный промотор достаточно силен для высокого накопления продукта внутри клетки-хозяина и может минимизировать такие нежелательные эффекты на рост клетки, как токсичность.
Выбранный маркер
Выбираемый маркер – это ген, сообщающий свойство, «пригодное» клетке-хозяину. Опция выбираемого маркера зависит от того, какая клетка-хозяин используется. Например, бета-лактамаза сообщает бактериальным клеткам-хозяевам резистентность к ампициллину.
Размер вектора
Здесь мы коснемся вопроса – с каким фрагментом ДНК – большим или маленьким – вы будете работать. Векторы должны быть небольшими молекулами для удобства их использования. Слишком большие векторы могут повлиять на репликацию и обусловить проблемы со стабильностью. Обычно плазмиды имеют последовательность до 15 kb. Но есть некоторые специальные плазмиды, которые содержат бОльшие последовательности.
Главная цель любой системы экспрессии – продукция рекомбинантного белка высокого качества и в достаточном количестве. Вектор экспрессии помогает «представить» инородный генетический материал клетке-хозяину, запускает экспрессию гена-мишени в клетке-хозяине и производит очищение белка-мишени. Поэтому выбор подходящего вектора экспрессии так важен.
Вектор экспрессии системы экспрессии E.coli
В настоящее время доступно множество систем экспрессии белков, такие, как E. coli, дрожии, клетки насекомых, клетки млекопитающих. Соответственно, доступны различные векторы экспрессии, которые могут быть использованы в различных системах экспрессии. Компания Кусабио предлагает некоторые векторы экспрессии E. coli по выгодной цене:
Expression Vector of E.coli Expression System
Cat No | Product Name | Size | Lead time | Expression system | Resistance | Tag | Protocol | |
CSB-PL200030 | pET-21a(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200031 | pET-21b(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200033 | pET-22b(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200529 | pET-23b(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200045 | pET-30a(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Kanamycin | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200048 | pET-32a(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | N-terminal 6xHis-Trx-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200049 | pET-32b(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | N-terminal 6xHis-Trx-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200097 | pGEX-6P-1 Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | N-terminal GST-tagged | Instructions | |
CSB-PL200093 | pGEX-4T-1 Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | N-terminal GST-tagged | Instructions | |
CSB-PL200094 | pGEX-4T-2 Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Ampicillin | N-terminal GST-tagged | Instructions | |
CSB-PL200038 | pET-26b(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Kanamycin | C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
CSB-PL200040 | pET-28a(+) Vector | 10 μg plasmid | 3-5 working days | E. coli Expression vector | Kanamycin | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | Instructions | |
Application: They are the expression vectors of E.coli expression system, you can subclone the synthesized gene to this vector and finish the expression vector construction, which can be used for subsequent protein expression. | ||||||||
Все вопросы по продукции Cusabio вы можете направить на электронную почту info@ld.ru
Источник
Вопрос 43. Эукариотами являются- дрожжи, грибы, водоросли, простейшие
Вопрос: 44. Ферменты, в зависимости от катализируемой реакции, подразделяют на классы -все
Вопрос: 45. Главный критерий отбора продуцента в качестве биообъекта в) способность синтезировать целевой продукт
Вопрос: 47. Донатор – это биологический объект г) поставляющий материал для производства лекарственных средств с прекращением дальнейшей жизнедеятельности
Вопрос: 48. Основные методы совершенствования биообъекта в современной биотехнологии – б) клеточная инженерия в) генная инженерия
Вопрос: 49. Скрининг лекарственных средств – в) поиск и отбор («просеивание») природных структур
Вопрос 50. Регуляция биосентетических путей по принципу обратной связи осуществляется способами- репрессии, ретроингибирование
Ретроингибирование конечным продуктом при биосинтезе БАВ – это (один верный ответ)
в) подавление всех ферментов метаболической цепи
б) активация биосинтеза всех ферментов метаболической цепи
а) подавление активности последнего фермента метаболической цепи
Г) подавление активности начального фермента метаболической цепи
Вопрос: 57. Оператор – это г) участок ДНК, связывающий белки-регуляторы транскрипции в прокариотической клетке
Вопрос: 59. Биосинтез ферментов синтеза метаболитов в клетке осуществляется если б) белок-репрессор
Вопрос: 60 Активность оператора оперона подавляется в результате а присоединения белка-репрессора
Вопрос 61. Биосинтез ферментов синтеза метаболитов прекращается в результате присоединения- белка-репрессора к оператору
Вопрос 62.Создание сверхпродуцентов целевого продукта основано на мутационном повреждении аллостерического центра6- а) первого фермента метаболической цепи, в) белка-репрессора
Вопрос: 63. Механизмы защиты клетки от собственного токсичного метаболита -ВСЕ
Вопрос 66. Мишенью для физических и химических мутагенов в клетке биообъектов являются- дезоксирибонуклеиновая кислота
Вопрос 67. Внутренние мутации- трансверсия, транзиция
Вопрос: 68. Транзиция – это вид внутригенной мутации, заключающийся: б) в замене пурина на другой пурин,в) в замене пиримидина на другой пиримидин
Вопрос: 69. Транслокация – это вид хромосомной мутации, заключающийся – а) в обмене участками между хромосомами
Вопрос 70. Трансверсия – это вид внутригенной мутации, заключающийся – в замене пурина на пиримидин, в замене пирмидина на пурин
Вопрос 71. Хромосомные мутации-ВСЕ,кроме траскрипции
Вопрос: 72. Репарация – это б) механизм исправления повреждений ДНК
Вопрос: 73. Реверант – это г) организм, возникий в результате повторной мутации
Вопрос 74. Преимущество клеточной инженерии перед скрещиванием- преодоление видовых и родовых барьеров
Вопрос 77.Для получения протопластов из клеток грибов используется- улиточный фермент
Вопрос: 78. За образованием протопластов из микробных клеток можно следить с помощью метода в) фазово-контрастной микроскопии
Вопрос: 79. Для получения протопластов из бактериальных клеток используется -лизоцим
Вопрос 80. Объединение геномов клеток разных видов и родов возможно при соматической гибридизации- только в искусственных условиях
Вопрос 81. Высокая стабильность протопластов достигается при хранении- в гипертонической среде
Вопрос: 82. Полиэтиленгликоль (ПЭГ), вносимый в суспензию протопластов а) способствут их слиянию
Вопрос: 83. Для протопластирования наиболее подходят суспензионные культуры – в) в логарифмической фазе
Вопрос: 85. для получения протопластов актиномицетов используется а) лизоцим
Вопрос 87. Зимолаза виноградной улитки обеспечивает получение протопласта- клеток гриба
Вопрос: 88. Лизоцим обеспечивает получение протопластов – в) бактерий д) актиномицетов
Комплекс целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, продуцируемый грибами, обеспечивает получение протопластов (один верный ответ)
в) клеток животных
г) актиномицетов
А) клеток растений
б) клеток грибов
Вопрос: 90. Гибридомы – это б) клеточные линии, полученные от слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток
Вопрос 91. Клоновая культура , наследственная однородность которой поддерживается отбором по специфическим признакам- по г) гибридомной технологии
Вопрос: 92. Гибридомы образуются в результате слияния в) В-лимфоцита и миеломной клетки
Вопрос: 93. Этапы получения гибридом-все
Иммунизация мышей антигеном в производстве гибридом проводится
А) внутривенно
Б) внутрибрюшинно
В) подкожно
Вопрос: 95. Для получения гибридом В-лимфоциты, выделяют из тканей б) селезёнки
Вопрос: 98. Трансплантацию опухоли в методе in vitro при культивировании гибридом осуществляют – б) внутрибрюшинно
Вопрос: 99. Культивирование гибридом in vitro осуществляют в биореакторах б) эрлифного типа
Вопрос 100. Моноклональные антитела очищаю методами – ионообменной хромотографией, гель-хроматографии, аффинной хроматографии
Вопрос 101. С целью хранения моноклональные антитела – замораживают при температуре 700С в жидком азоте
Вопрос: 102. Гибридомы иммобилизуют – а) в микрокапсулы альгината б) в капсулы агарозы в) в полые волокна«Милипор»
Вопрос: 103. Культура тканей растений – это в) выращивание в стерильных искусственных условиях изолированных клеток, тканей, органов растений на твердых или жидких питательных средах
Вопрос: 105. Основное преимущество растительного сырья, получаемого при выращивании культур клеток перед сырьём, получаемым из плантационных или дикорастущих растений – в) стандартность
Вопрос: 106. Время генерации клетки – в) интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями…….
Вопрос: 107. Тотипотентность – ВСЕ
Вопрос 108. Индуктором реализации тотипотентности клеток и тканей растения являются- фитогормоны
Вопрос 109. Тип питания культуры тканей растения- хемогетеротрофный
Вопрос: 111. Клеточный цикл – это а) существование клетки отделения до следующего деления или смерти
Вопрос: 112. Эксплант – это а) изолированные из растения фрагменты ткани
Вопрос 113. Эксплант стерилизуют методом- химическим
Вопрос 114.Дифференцировка клеток тканей растений при наличии индукции происходит- в пресинтетическую фазу
Вопрос: 116. Выход продуктов вторичного метаболизма выше а) в каллусных культурах
Вопрос: 117. Эксплант выполняет в биотехнологическом процессе функцию – б) получения первичного каллуса
Вопрос: 118. Эксплант стерилизуют б) обработкой растворами солей ртути с добавлением IIАВ, д) обработкой растворами водорода пероксида с добавлением ПАВ
Вопрос: 119. Возможность управления процессами культивирования тканей растений выше а) в суспензионных культурах
Вопрос: 121. Ауксины – термин, под которым объединяются специфические стимуляторы роста а) растительных тканей
Вопрос: 122. Инокулюм выполняет в биотехнологическом процессе функцию в) субкультивирования суспензионной культуры
Вопрос: 123. Трансплант – это а) часть каллусной культуры, используемой для пересадки на свежую питательную……
Вопрос: 124. Инокулюм — это б) часть суспензионной культуры, используемой для пересадки на свежую питательную среду
Вопрос 125. Цитокинины- это гормоны растений, производные 6-аминопурина……….
Вопрос: 127. Ауксины – это а) гормоны растений, производные индола, образуются в опекальных меристемах и стимулирующие клеточные растяжение и дедифференцировку клеток
Вопрос: 129. В качестве ауксинов в питательные среды для культивирования ткани вводят а) α-нафтилуксусную кислоту, б) индолил-3-уксусную кислоту
Вопрос 130.Интенсивность синтеза алкалоидов культурой тканей катарантуса розового можно повысить в результате- внесения фитопатогенов
Вопрос 131. Клетки культуры ткани растений иммобилизирую, если целевой продукт- водорастворим, секретируется в питательную среду
Вопрос: 132. Интенсивность синтеза флавоноидов культурой тканей растений можно повысить в результате а) воздейсвия УФ-лучами
Вопрос 133. Культура клеток женьшеня осуществляет- синтез панаксозидов
Вопрос: 134. Из культуры клеток Воробейника краснокорневого выделяют – г) шиконин
Из культуры клеток Табака курительного выделяют
Б) убихинон
Д) никотин
Вопрос 136.культура клетки Digitalis lanata осуществляет – биоконверсию диготоксина в дигоксин
Вопрос: 138. Из культуры ткани Стевии выделяют г) рутин
Вопрос: 139. Из культуры ткани Родиолы розовой выделяют г) триандрин
Вопрос: 140. Из культуры ткани Раувольфии змеиной выделяют – в) аймалин
Вопрос 141. Из культуры клеток Воробейника краснокорневого выделяют-шикошин
Вопрос143. Превращение карденолида дигитоксина в менее токсичный дигоксин осуществляется культурой клеток – Digitalis lanata
Вопрос: 144. Генетическая инженерия получила практическое применение после в) формулирования молекулярной концепции гена
Вопрос: 145. Термин «технология рекомбинантных ДНК» идентичен терминам а) генная инжнерия, б) клонирование генов ,д) генетическая инженерия
Вопрос: 147 Транскриптон – это: а) отрезок ДНК, подвергающийся транскрипции
Вопрос: 148. Установите правильную последовательность: Этапы технологии рекомбинантных ДНК 1) встраивание гена-мишени в вектор; 2) введение гена-мишени в составе вектора в организм-реципиент; З) скрининг и селекция клеток, которые приобрели ген-мишень; 4) получение гена-мишени Ответ по коду: в) С – верно 4,1,2,3
Вопрос 149. Интроны- участки генов эукариотических органов, которые не несут генетической информации, кодирует синтез белка
Кишечную палочку в качестве системы для экспрессии чужеродных генов используют благодаря (один верный ответ)
в) способности модифицировать белки
б) способности к сплайсингу
г) способности продуцировать внеклеточные метаболиты
А) детальной изученности
Вопрос 151. Bacillus subtilis в качестве системы для экспрессии чужеродных генов используют благодаря способности осуществлять- продуцирование внеклеточных метаболитов
Вопрос: 152. Эукариотические продуценты в качестве систем для экспрессии чужеродных генов используют благодаря их способности осуществлять г) посттрансляционные модификации белков
Вопрос 153.Saccharomyces cerevisiae в качестве системы для экспрессии чужеродных генов используют благодаря способности осуществлять- ВСЕ
Роль вектора в технологии рекомбинантных ДНК выполняют
В) бактериофаги
Д) фазмиды
Г) космиды
Е) микоплазмы
А) плазмиды
Б) вирусы
Вопрос: 155. Причина невозможности непосредственной экспрессии гена человека в клетке прокариот г) невозможность сплайсинга
Вопрос: 156. Понятие «липкие концы» применительно к технологии рекомбинантных ДНК отражает а) комплементарность нуклеотидных последовательностей
Вопрос: 157. Рестриктаза E.coli узнаёт и гидролизует нуклеотидную последовательность б) G↓ААТТС
Вопрос: 158. Биотехнологу «ген-маркер» необходим г) для отбора рекомбинантов
Вопрос: 159. Природная роль рестриктаз – а) защита бактериальных клеток от инфицирования фагами, б) ограничение скрещивания между различными бактериальными видами и штаммами
Вопрос: 160. Субстратами рестриктаз, используемых в технологии рекомбинантных ДНК, являются – в) нуклеиновые кислоты
Вопрос: 161. Рестриктазы используются в технологии рекомбинантных ДНК поскольку – специфически расщепляют двухцепочечную ДНК по сайтам узнавания
Вопрос: 162. Поиск новых рестриктаз для использования в технологии рекомбинантных ДНК объясняется – б) различным местом воздействия на субстрат
Вопрос: 163. Природная роль лигаз – в) воссоединение молекул ДНК бактерий после расщепления г) соединение молекул ДНК бактерий и бактериофага
Вопрос: 164. Фермент лигаза используется в технологии рекомбинантных ДНК поскольку – в) катализирует ковалентное связывание углеводно-фосфорной цепи ДНК гена и ДНК вектора
Вопрос: 165. Универсальную ДНК выделяют в) из фага Т4
Вопрос: 166. ДНК-лигаза фага Т4 катализирует реакцию воссоединения фрагментов ДНК б) как с липкими, так и с тупыми концами
Вопрос: 167. Природная роль обратной транскриптазы д) интеграция генома ретровируса в виде ДНК в хромосомы клетки хозяина
Вопрос: 168. Обратная транскриптаза используется в технологии рекомбинантных ДНК поскольку б) катализирует синтез комплементарной ДНК на матрице РНК, соответствующей гену-мишени
Вопрос: 169. Линкеры все кроме Г
ДНК-полимераза используется в технологии рекомбинантных ДНК поскольку (один верный ответ)
д) специфически расщепляет одноцепочечные участки нуклеиновых кислот
а) катализирует ковалентное связывание углеводно-фосфорной цепи ДНК гена и ДНК вектора
б) катализирует синтез комплементарной ДНК на матрице РНК, соответствующей гену-мишени
в) специфически расщепляет двухцепочечную ДНК по сайтам узнавания
Рекомендуемые страницы:
Воспользуйтесь поиском по сайту:
Источник