Методические рекомендации по диагностике кишечных инфекций

1. РАЗРАБОТАНЫ:
Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека (к.м.н. Ю.В.Демина); ФГУН “МНИИЭМ им.
Г.Н.Габричевского” Роспотребнадзора (к.м.н. Л.В.Пожалостина); МУЗ
“Клиническая инфекционная больница” г.Липецка (к.м.н. А.В.Гритчина,
В.И.Мищук).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к
утверждению Лабораторным Советом Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от
25.06.08).

3. УТВЕРЖДЕНЫ
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 26 декабря 2008
г. N 01/15702-8-34

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1.
Область применения

1.1. В методических
рекомендациях представлена доступная для практических
бактериологических лабораторий методика бактериологического
исследования на кампилобактериоз больных острыми кишечными
инфекциями с учетом современных возможностей лабораторной техники
по созданию условий для культивирования и идентификации
кампилобактерий.

1.2. Методические
рекомендации предназначены для врачей бактериологов,
инфекционистов, эпидемиологов и врачей других специальностей.

2.
Общие положения

В
настоящее время, по данным ВОЗ, во многих зарубежных странах
кампилобактериоз является наиболее распространенной этиологической
формой в структуре ОКИ и в зависимости от региона на его долю
приходится от 3 до 73% всех расшифрованных острых кишечных инфекций
[1, 11].

Изучение
кампилобактериоза в Российской Федерации начато с большим
опозданием, что сопряжено с рядом причин, в основном со сложностью
и высокой стоимостью лабораторной диагностики, обусловленными
особенностями культивирования кампилобактеров. Так в 2005-2007 гг.
по всей России официально зарегистрировано всего 394-398 случаев
этой инфекции (показатель на 100 тыс. населения – 0,27-0,28
соответственно). Показатель заболеваемости на 100 тыс. населения по
сальмонеллезу за тот же период составил 29,33, 31,96 и 35,5
соответственно. При этом кампилобактериоз выявлен только в 14 из 85
административных территорий России. Таким образом,
кампилобактериозная инфекция, столь широко распространенная во всем
мире, и по частоте выявления сопоставимая с сальмонеллезом, в
России диагностируется очень мало [11].

Для лабораторной
диагностики кампилобактериозного энтероколита кроме основного
бактериологического метода с выделением чистой культуры возбудителя
могут быть использованы и другие методы.

Бактериоскопический метод
основан на обнаружении в окрашенном препарате микроорганизмов с
характерной морфологией (мелкие изогнутые S-образные палочки –
“крылья летящей чайки”) или клеток с характерной морфологией в
сочетании с молниеносной подвижностью (препарат “раздавленная
капля” при фазово-контрастной или темно-польной микроскопии).
Бактериоскопический метод является достоверным лишь при
обсемененности не менее 10 КОЕ в 1 мл материала и имеет только
дополнительное, ориентировочное значение в диагностике
кампилобактериоза [6].

Серодиагностика при
кампилобактериозе имеет вспомогательное значение и может быть
проведена для ретроспективной диагностики при отсутствии выделения
возбудителя, при эпидемиологических исследованиях и изучении
патогенеза. Исследование парных сывороток при кампилобактериозной
инфекции не имеет такого большого диагностического значения как при
многих других кишечных заболеваниях, поскольку отчетливое
увеличение титров антител наблюдается только у одной трети больных
[14].

Для ускоренной индикации
кампилобактеров в разное время предлагали использовать
иммунологические реакции, такие как реакция коагглютинации,
иммуноферментный анализ [3, 12]. Однако они не могут широко
использоваться в практических лабораториях из-за ограниченного
производства тест-систем.

Одним из наиболее
распространенных альтернативных методов индикации кампилобактерий
являются методики, основанные на амплификационных технологиях и в
частности – методе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В связи с
высокой частотой циркуляции в популяции здоровых лиц сапрофитных
видов кампилобактерий для диагностики кишечных форм
кампилобактериоза применяются тест-системы, позволяющие выявлять
только термофильную группу этих микроорганизмов и разрешенные к
применению на территории Российской Федерации в установленном
порядке. Предпочтение при этом должно отдаваться тест-системам,
обеспечивающим более высокий уровень контаминационной защищенности
при проведении исследований.

Предлагаемая методика
микробиологической диагностики кампилобактериозной инфекции
учитывает современные возможности лабораторной техники по созданию
условий для культивирования и идентификации кампилобактеров, и
будет способствовать эффективной диагностике данного заболевания в
условиях бактериологических лабораторий лечебно-профилактических
организаций и ФГУЗ “центров гигиены и эпидемиологии”, его
адекватной терапии и осуществлению мониторинга за циркуляцией
возбудителя.

Апробация разработанной
методики в условиях микробиологической лаборатории инфекционной
больницы г.Липецка при обследовании 11607 больных ОКИ подтвердила
эффективность ее использования для диагностики кампилобактериозной
инфекции. Так, высеваемость кампилобактеров за 2002-2005 гг. в
г.Липецке в среднем составила (1,8±0,12)%, что более чем в 2 раза
выше уровня высеваемости шигелл за анализируемый период (0,8%), но
ниже высеваемости сальмонелл (3,2%).

3.
Описание метода

3.1.
Формула метода

Способ бактериологической
диагностики кампилобактериоза, включающий выделение чистой культуры
возбудителя, с использованием специальных питательных сред и
капнофильных условий культивирования, и последующей ее
идентификацией.

3.2.
Показания и противопоказания к применению метода

Показанием к проведению
бактериологического исследования биологического материала на
кампилобактериоз является необходимость обследования:

больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ)
– с диагностической целью;

лиц, контактных с больными ОКИ, – по
эпидемическим показаниям;

реконвалесцентов кампилобактериоза – для
контроля лечения и выявления бактерионосительства.

Противопоказания к
использованию метода отсутствуют.

3.3.
Материально-техническое обеспечение метода

3.3.1. Стандартное
испытательное и вспомогательное оборудование, средства измерения
для микробиологических лабораторий.

3.3.2. Питательные среды,
химические реагенты, оборудование для культивирования, выделения,
идентификации кампилобактерий, в том числе:

трековые мембраны с диаметром пор 0,46 и
0,55 мкм (типа изготовляемых лабораторией ядерных реакций им.
Г.Н.Флерова ОИЯИ, г.Дубна и др.);

сухие газогенерирующие пакеты типа
“Кампилогаз” (типа пакетов, выпускаемых ООО “ИНКО”,
г.Санкт-Петербург и др.);

термостат с регулируемой газовой средой или
микроанаэростат или системы для инкубации микроаэрофильных и
анаэробных микроорганизмов (типа CampyPack Plus jar, Campy Pack
(Becton Dickinson), Genbag, Genbox anaer (bio Merieux, Hi Media и
др.).

3.3.3. Для лабораторной
диагностики кампилобактериоза должны использоваться питательные
среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации в установленном порядке.

4.
Бактериологический метод диагностики кампилобактериозной
инфекции

Возбудители
кампилобактериоза первоначально были отнесены к роду Vibrio
семейства Vibrionaceae, а выделенный вид был назван
V.fetus. В 1963 г. по предложению Sebald M. и Veron M.,
доказавших различия между микроаэрофильной группой V.fetus и
истинными вибрионами при изучении состава оснований ДНК, род
Campylobacter, как новый таксон, был введен в семейство
Spirillaceae. В настоящее время микроаэрофильные подвижные,
хемоорганотрофные, не образующие спор и капсул грамотрицательные
бактерии спиралевидной, S-образной или изогнутой формы объединены в
семейство Campylobacteriaceae, a род Campylobacter
насчитывает, по последним данным, около 20 видов и подвидов, и это
число постоянно растет, уточняются потенциальные возможности данных
микроорганизмов в этиологии и патогенезе заболевания у человека.
Наибольшее значение для патологии человека на сегодня имеют
C.jejuni, С.coli, С.lari, С.fetus.
Последний вид чаще поражает ослабленных интеркуррентными
заболеваниями людей с развитием гематогенно-диссеминированных форм
заболевания [9].

Длина клеток
кампилобактеров 0,5-5 мкм, толщина – 0,2-0,8 мкм, имеют один или
два полярно расположенных жгутика, могут обладать плазмидами. В
старых культурах бактерии часто принимают сферические или кокковые
формы.

Кампилобактерам присущ
дыхательный тип метаболизма. В качестве источника энергии они, в
основном, используют аминокислоты, но не могут утилизировать
углеводы. Кампилобактеры – микроаэрофилы. Кислород необходим для их
роста, но становится токсичным для микроорганизмов в избыточном
количестве. Для большинства штаммов оптимальной является
концентрация кислорода 3-6%. Кампилобактериии являются капнофилами,
то есть нуждаются в высоких концентрациях СО (до 10%). Большинство этиологически
значимых кампилобактеров обладают каталазой, оксидазой и
супероксиддисмутазой.

В
зависимости от температурного диапазона роста кампилобактеры делят
на 2 группы: 1) нетермофильные (C.faecalis,
С.hyointestinalis, С.fetus, С.consicus) –
температурный оптимум 37 °С; 2) термофильные (С.jejuni,
С.coli, С.lari) – температурный оптимум 42-43 °С.

На жидких питательных
средах через 48 ч инкубации кампилобактер образует равномерное
помутнение с выраженным осадком, на полужидких пробирочных
питательных средах – зону роста в виде диска, расположенного на
глубине 1-2 мм от поверхности питательной среды.

С.jejuni на
плотных питательных средах с добавлением крови образуют колонии без
гемолиза 2-х типов:

1) низкие, плоские, с
краями неправильной формы, блестящие, влажные, полупрозрачные,
растекаются по поверхности среды, имеют тенденцию к слиянию
(характерны для “свежих” культур, содержащих извитые формы клеток);
2) круглые, гладкие, приподнятые, с ровными краями, 1-2 мм в
диаметре (характерны для “старых” культур, содержащих кокковидные
формы) [3].

На полужидких средах
С.jejuni растут в виде диска, 3-5 мм от поверхности среды.
С.coli на плотных питательных средах с добавлением крови
образуют колонии диаметром 1-2 мм без гемолиза, гладкие, выпуклые,
блестящие с рыжевато-коричневым оттенком.

Принцип
бактериологического метода основан на выявлении живых
микроорганизмов в исследуемом субстрате при посеве на специальные
питательные среды с последующей инкубацией в термостате при
заданной температуре в микроаэрофильных условиях. Изучение
культуральных и ферментативных свойств полученных микроорганизмов
позволяет идентифицировать бактерии рода Campylobacter.

При кампилобактериозе
бактериологическое исследование обеспечивает постановку
этиологического диагноза и контроль освобождения организма от
возбудителя. При дифференциальной диагностике кампилобактериоза от
других острых кишечных инфекций бактериологическое исследование с
выделением возбудителя является единственным методом, так как
клиническое течение инфекционного процесса не всегда позволяет
различить эти нозологические формы.

4.1.
Схема бактериологической диагностики кампилобактерий

Проводить
бактериологическое исследование с диагностической целью необходимо
в наиболее ранние сроки от начала заболевания, до начала
антибиотикотерапии.

4.2.
Сбор материала для исследования

Материалом для
исследования являются испражнения. Техника взятия исследуемого
материала не отличается от техники, применяемой при других ОКИ.

Отбор нативного
материала.

Испражнения не менее 1 г
собирают сразу после естественного акта дефекации из судна, горшка
(тщательно вымытого и не содержащего следов дезинфектантов) или с
пеленки с помощью стерильной стеклянной палочки, проволочной петли
или деревянного шпателя и помещают в стерильную посуду (стеклянную
пробирку, вакуумный пробоотборник, контейнер транспортировочный со
средой для анаэробов или специальными средами с активированным
углем и без него для выделения Campylobacter spp.). При
наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, хлопья,
эпителий, гной), за исключением крови, их включают в отбираемую
пробу.

Отбор с использованием
ректальных петель (тампонов).

Стерильную ректальную
петлю (тампон) вводят в прямую кишку на глубину 5-6 см. Взятый
материал переносят в стерильную пробирку с физиологическим
раствором или в транспортную среду. Попадание транспортных сред на
слизистую оболочку прямой кишки недопустимо!

Условия и сроки
хранения и транспортирования проб.

При возможности доставки
нативных фекалий в лабораторию в течение 1 ч, транспортные среды
можно не использовать.

При необходимости
продолжительного транспортирования используют транспортные среды:
0,1%-я пептонная вода, среда контроля стерильности, среда Amies,
среда Сагу-Blair (прилож.1). Соотношение материал/среда должно быть
1:3-1:5. Применение транспортных сред обязательно при отборе проб
ректальными петлями [3].

Сроки хранения материала
в транспортных средах при температуре 4 °С в зависимости от вида
среды в:

изотоническом растворе натрия хлорида в
течение 24 ч;

0,1%-й пептонной воде – 72 ч;

среде для контроля стерильности, среде
Amies, среде Сагу-Вlair – 5-7 сут.

4.3.
Этапы бактериологического исследования

Задачей первого этапа
бактериологического исследования является выделение чистой
культуры кампилобактеров. С этой целью возможны 2 варианта
посева исследуемого материала:

1 – посев на селективные питательные
среды;

2 – посев с использованием ядерных
фильтров.

Первый вариант
предусматривает посев испражнений непосредственно на питательные
среды (кровяной эритрит агар, угольный эритрит агар,
кампилобакагар) с использованием добавок: аэротолерантных (железа
II сульфата, натрия пирувата, натрия метабисульфита в концентрации
0,025% каждой из солей (прилож.1) и селективных (смеси антибиотиков
для подавления сопутствующей микрофолоры (прилож.2). Перед посевом
фекальные пробы суспензируют в изотоническом растворе NaCI или в
0,1%-й пептонной воде в соотношении 1:10.

Применение метода
ядерных фильтров позволяет производить посев материала на
неселективные питательные среды. Использование ядерных фильтров с
диаметром пор 0,46 и 0,55 мкм и отказ от внесения в среду
селективных добавок способствует: сокращению времени выделения
кампилобактерий до 24 ч инкубации; возможности обнаружения разных
видов кампилобактерий; росту возбудителя в чистой культуре, что
значительно упрощает учет результатов посева; снижению стоимости
анализа.

Ядерные фильтры размером
3х3 см, стерилизованные автоклавированием при 121 °С в течение 30
мин, переносятся пинцетом на подсушенную питательную среду. Затем
на поверхность фильтров пипеткой наносят 0,1 мл суспензии фекалий в
стерильном изотоническом растворе натрия хлорида или консерванте.
Через 30 мин экспозиции фильтры удаляют. Допускается повторное
использование ядерных фильтров после обеззараживания кипячением в
дистиллированной воде в течение 5 мин (без интенсивного кипения
воды), промывания в проточной воде, просушивания, визуальной
проверки целостности, стерилизации автоклавированием при 121 °С в
течение 30 мин [4].

Инкубация всех
посевов проводится при температуре 42,5-43,0 °С в
микроаэрофильных и капнофильных условиях. Оптимальные условия для
культивирования кампилобактеров создает атмосфера, содержащая 5%
кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота. Длительность инкубации
составляет 48 ч с обязательным просмотром посевов через 24 ч.

Необходимые устройства
для культивирования кампилобактерий: термостат с регулируемой
газовой средой; микроанаэростаты; эксикаторы; сборник для твердых
радиоактивных отходов; системы для инкубации Genbox и
др.

Способы создания
газовой смеси: использование газовой смеси из баллонов;
химические газогенерирующие пакеты.

4.4.
Идентификация выделенной культуры

На следующем этапе
исследования проводится идентификация выделенной
культуры.

При обнаружении
подозрительных колоний из них готовят мазки с последующей окраской
кристалл-виолетом или 1%-м раствором фуксина. При выявлении
микроорганизмов с характерной морфологией (изогнутые палочки
S-образные или в виде крыльев чайки) проводят традиционные тесты:
определение цитохромоксидазы (с использованием стандартных наборов
и реактивов для определения цитохромоксидазы), продукция каталазы
со свежеприготовленным 3%-м раствором перекиси водорода, KОН-тест с
3%-м раствором KОН.

В
настоящее время возможна первичная идентификация колоний,
подозрительных на кампилобактериозные, с помощью латексного
агглютинационного набора (типа Campylobacter test kit фирмы
OXOID), который состоит из карт с сухим кампилобактер-реагентом,
имеющих тестовую и контрольную поверхность, экстрагирующего
реагента 1 (раствора уксусной кислоты), экстрагирующего
нейтрализующего реагента 2 (трис буфера, содержащего 0,09% азида
натрия в качестве консерванта), положительного контрольного
реагента.

Методика основана на
взаимодействии латексных частиц тестовой поверхности,
сенсибилизированных кроличьими антителами, с поверхностными
антигенами отобранных клеток кампилобактера.

Подозрительную колонию
сначала смешивают с каплей реагента 1 в экстракционной пробирке,
оставляют на 3 мин. Затем добавляют 2 капли экстрагирующего
нейтрализующего реагента 2, тщательно перемешивают. Используя
веслообразную пастеровскую пипетку, помещают 1 каплю (50 мкл)
нейтрализующего экстракта на тестовой круг и 1 каплю на контрольный
круг. Веслообразным концом пастеровской пипетки сначала
перемешивают экстракт и сухой контрольный реагент, затем эта
процедура повторяется и для тестового реагента.

Учет реакции в течение
3-х мин покачивания карты без использования увеличительного стекла.
Результат является положительным, если агглютинация латексных
частиц происходит через 3 мин, что указывает на присутствие
Campylobacter spp. Реакция считается отрицательной, если
агглютинация в тестовом окне отсутствует. Реакции, наступающие в
тестовом окне после 3-х мин, игнорируются. Тест не подлежит
интерпретации, если происходит агглютинация с контрольным
реагентом, что указывает на аутоагглютинацию культуры.

Для определения вида
выделенной культуры основным тестом является гидролиз
гиппурата, позволяющий дифференцировать C.jejuni от других
видов. Кроме того, для идентификации используют также определение
устойчивости к налидиксовой кислоте, цефалотину, температурный
тест, ТТХ (0,04% трифенилтетразолий хлорид), продукция
нитратредуктазы и др.

Важнейшие фенотипические признаки термофильных
кампилобактеров