Молекула фермента триптофансинтетазы кишечной палочки

Инсулин – это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата.

Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков.

При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание – диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние – диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800-1000 кг исходного сырья. Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин построен из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот, последовательность которых была установлена Сэнгером в 1955 г. Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены тремя коллективами исследователей в Сша, Китае и ФРГ в 1963 и 1965 гг. Однако осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Тем не менее в 1980 г. в Дании (компанией «Ново индастри») был разработан способ превращения инсулина свиньи в инсулин человека замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В на остаток треонина.

Это удалось достигнуть путем ферментативного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта; в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. Исследования двух однокомпонентных инсулинов (человеческого и свиного) показали, что они не различались по активности и по времени действия. В 1982 г. инсулин производили главным образом две компании «Эли Лилли» (85 % сбыта инсулина в США и патент на его производство с 1923 г.) и «Ново индастри» (47,5 % сбыта гормона в Европе).

В организме животного две полипептидные цепи инсулина исходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 аминокислот – препроинсулина. При синтезе препроинсулина в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для прохождения молекулы сквозь мембрану клетки; эти аминокислоты отщепляются, образуется проинсулин длиной 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный ее сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется с помощью ферментов.

Так образуется инсулин. Роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.

Гилберт с сотрудниками выделили и-РНК из поджелудочной железы крысы, синтезировали ДНК-копию (комплементарная ДНК), которая была встроена в плазмиду E. coli в среднюю часть гена пенициллиназы (этот фермент в норме секретируется из клеток), и получили рекомбинантную плазмиду. Как показало определение последовательности ДНК, рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина, но не препроинсулина.

При трансляции и-РНК в клетках кишечной палочки синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Далее отщепляли пенициллиназу и удаляли средний сегмент проинсулина действием трипсина. Позднее было показано, что полученные таким образом молекулы влияют на сахарный обмен, как гормон, выделенный из поджелудочной железы крысы.

В 1979 г. в США были синтезированы гены, кодирующие А и Б цепи инсулина. Далее каждый синтетический ген встраивали в плазмиду E. coli в конце гена -галактозидазы. После этого синтезированные полипептиды отщепляли от фермента, проводили их очистку и цепи соединяли in vitro для получения полной молекулы инсулина.

В клетках E. coli был также осуществлен биосинтез проинсулина, а не только отдельных ее цепей. Для этого на и-РНК проинсулина синтезировали ее ДНК-копию с помощью обратной транскриптазы (ДНК-полимераза). Этот способ имеет серьезное преимущество, поскольку различные этапы экстракции и выделения гормона сведены к минимуму. С помощью этого метода был получен высокий выход гормона -200 г на 1000 л культуральной жидкости (это эквивалентно количеству инсулина, выделенного из 1600 кг поджелудочной железы животных).

Исследователям из компании «Генентек» потребовалось 10 месяцев, чтобы в сентябре 1978 г. получить инсулин человека в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Этот инсулин прошел самые серьезные и длительные испытания, которые показали, что он не вызывает никаких побочных явлений, как инсулин животных (у одного из каждых 20-ти больных инсулин животных вызывает аллергию; часто наблюдаются также расстройства почек и зрения ).

Кроме того, при длительном применении препарат не вызывал отрицательных иммунологических реакций.

Технология производства инсулина в бактериальных клетках имеет огромные преимущества перед получением инсулина из поджелудочной железы животных: не зависит от перебоев или количества сырья, конечный продукт всегда имеет одинаковый состав и степень чистоты.

В октябре 1982 г. был налажен выпуск «хемулина» (препарата синтетического инсулина человека) фирмой «Эли Лилли», которая затратила 100 млн долларов, чтобы начать поставку продукта на рынок.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Опубликовал Константин Моканов

Escherichia coli

Ученые из университета Эмори (Атланта, США) показали, что
индол – вещество, вырабатываемое кишечными бактериями – улучшает функциональные
показатели у старых животных и, таким образом, обеспечивает более здоровую
старость, при этом не влияя на максимальную продолжительность жизни. Эффект
воспроизвели на нематодах, мушках-дрозофилах и мышах. Кроме того, индол
увеличил сопротивляемость стрессу и выживаемость после облучения у молодых
мышей. Исследователи предполагают, что их открытие в перспективе поможет
улучшить качество жизни пожилых людей и сократить расходы на здравоохранение. Статья опубликована в журнале Proceedings of the National
Academy of Sciences.

Одна из задач здравоохранения будущего – продление максимальной
продолжительности жизни человека и увеличение продуктивного возраста, когда дряхление
и старческие болезни не ухудшали бы качество жизни. В ряде экспериментов ученым
удалось удлинить жизнь модельных животных, например, нематоды Caenorhabditis elegans и
мышей, однако,
как правило, увеличение общей продолжительности жизни сопровождается также увеличением
периода немощной старости.

В лабораторных исследованиях на животных главными качествами, присущими
«молодости», являются нормальная подвижность, способность к размножению и
способность переносить стрессовые воздействия, а также восстанавливаться после
них. Сохранение этих критериев с возрастом – показатель «здоровой
продолжительности жизни» (healthspan), или «здоровой старости». Именно ее
изучали авторы работы на трех видах модельных организмов – червях-нематодах,
дрозофилах и мышах.

В экспериментах ученые измеряли подвижность животных и реакцию на
тепловой стресс (нагревание), либо, в случае мышей, на облучение. Главным
параметром, который изменялся в эксперименте, был состав микробиоты животных.
Кишечник подопытных животных заселяли либо обычной кишечной палочкой Escherichia coli,
либо мутантным штаммом, у которого отсутствовал ген триптофаназы (TnaA) – фермента, который разлагает триптофан с образованием индола.

Индол является продуктом жизнедеятельности многих кишечных бактерий и
используется последними как сигнальная молекула. Это вещество в больших
количествах содержится в фекалиях и определяет их запах, однако в низких
концентрациях обладает цветочным ароматом. Индол может быть получен из
триптофана – аминокислоты, которая также является предшественником
нейромедиатора серотонина, и содержится в пище. Кроме того, производные индола
вырабатывают растения, в том числе съедобные.

Ранее было показано, в том числе авторами обсуждаемой статьи, что индол
улучшает сопротивляемость организма стрессовым воздействиям. В новой работе
ученые показали, что индол необходим для продления продуктивного возраста
животных. Особи, кишечник которых заселяли кишечной палочкой, не способной
производить индол, проявляли признаки дряхления организма раньше. Кривая
выживаемости таких животных сдвигалась влево, т.е. в каждой возрастной группе
больше особей умирало, несмотря на то, что максимальная продолжительность жизни
не изменилась.

Если же индол либо его производные дополнительно добавляли животным в
пищу, выживаемость увеличивалась, а подвижность и способность противостоять
стрессу дольше сохранялись. На червях C.elegans было
показано, что добавление в пищу индола способствует увеличению репродуктивного
периода (способности к размножению). Кроме того, индол поспособствовал увеличению
выживаемости молодых мышей, которых подвергли смертельным дозам радиации.

Ученые обнаружили, что индол действует, связываясь с рецептором AHR (aryl
hydrocarbon receptor). Этот рецептор является сенсором малых биологически
активных молекул и в ответ на связывание опосредует изменение экспрессии ряда генов.
Этот рецептор очень консервативен, соответствующий ген есть как у низших животных,
так и у млекопитающих. Теоретически это означает, что похожий эффект индол
может оказывать и на людей.

Ранее
мы писали, что ученые ограничили продолжительность человеческой жизни 115
годами. Пока эффект индола на людях не доказан, зато известно, что здоровому
долголетию способствует поздний выход на пенсию, книги, кофе и положительные
личные качества, такие как добросовестность и оптимизм.

Дарья Спасская