Набор ифа на вирусную диарею

Подготовка исследуемого материала

Для обнаружения антигена вируса диареи в качестве испытуемого материала используют слизистую носовой перегородки, миндалины, трахею, пораженные (изъязвления, воспаления) участки слизистой оболочки носа, носовой перегородки, фрагменты тонкого и толстого кишечника. От больных в острой стадии заболевания животных берут пробы носовой слизи при ринитах и фекалий при поносах.

Для обнаружения рота- и коронавирусных антигенов в качестве испытуемого материала используют фекалии, фрагменты тонкого и толстого кишечника.

Для получения 25-50% суспензии кусочки материала тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования однородной кашицеобразной массы. Вносят физиологический раствор. Полученную суспензию промораживают в течение 18-20 ч при – 20°С, оттаивают и осветляют центрифугированием при 4000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду, инкубируют при 4°С в течение 2-3 ч и используют для исследования.

Для постановки ИФА необходимы одно- и многоканальные автоматические микропипетки разных объемов со сменными наконечниками, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода.

Подготовка компонентов набора для постановки реакции

Растворение компонентов реакции проводят на 0.01 М калий-фосфатном буфере (рН 7.2-7.4), для приготовления которого содержимое флаконов №11 (0.01 М калий фосфатный буфер) и №12 (натрий хлористый) растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды и полученный фосфатно-буферный раствор (ФБР) хранят при 4-8 °С в течение месяца.

Содержимое ампул со специфическими (ротавирусным, коронавирусным, диарейным) антигенами растворяют в 0.1 см3 ФБР каждую, а с отрицательным – в 0.3 см3 ФБР.

Для промывания планшетов и разведения компонентов при постановке реакции готовят ТФБР: к 1 дм3 ФБР добавляют 0.5 см3твин-20 или твин-80 (флакон №10) и перемешивают до полного растворения.

Содержимое ампул с иммуноферментными (ротавирусным, диарейным, коронавирусным) коньюгатами растворяют в 5 см3 ТФБР каждую.

Субстратную смесь готовят непосредственно перед использованием в реакции следующим образом: содержимое ампулы с 5-аминосалициловой кислотой (№8) растворяют в 10 см3 подогретой до 30-40°С дистиллированной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампулы с гидроперитом (№ 9).

Постановка реакции

Реакцию проводят на планшете, сенсибилизированном иммуноглобулинами:

1-4 ряд – ротавирусные иммуноглобулины;

5-8 ряд – диарейные иммуноглобулины;

9-12 ряд – коронавирусные иммуноглобулины

На первом этапе реакции во все лунки планшета вносят по 0.1 см3ТФБР. При качественной реакции (ответ “да” или “нет”) в первые лунки 1-го,5-го и 9-го рядов вносят по 0.1 см3 испытуемой пробы, пипетируют и 0.1 см3 раствора удаляют. В одну из лунок 4-го ряда таким же образом вносят ротавирусный антиген, в лунку 8-го ряда диарейный антиген, в лунку 12-го ряда – коронавирусныи антиген. Такимже образом вносят отрицательный антиген. При количественной постановке реакции пробы титруют методом двойных разведений с 1:2 до 1:256 на ТФБР. Планшет накрывают крышкой, инкубируют в термостате 1.5-2 ч при 36-37°С и затем отмывают лунки планшета от несвязавшихся антигенов следующимобразом. Планшет освобождают от содержимого резким встряхиванием и трижды отмывают ТФБР, каждый раз полностью заполняя лунки буфером ивытряхивая содержимое. Затем микропанель подсушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

В отмытые лунки планшета с 1-го по 4-ый ряд вносят по 0.1 см3 ротавирусный иммуноферментный коньюгат, в лунки с 5-го по 8-ой ряд – диарейныйиммуноферментный коньюгат по 0.1 см3, с 9-го по 12-ый ряд – коронавирусный иммуноферментный коньюгат по 0.1 см3, разведенные как указано выше, инкубируют в термостате при 36-37°С 1.5-2 ч и вновь четырежды отмывают раствором ТФБР.

Затем в лунки вносят по 0.1 см3 субстратной смеси, которую готовят непосредственно перед использованием в реакции.

Учет результатов

Результаты реакции учитывают через 40-60 мин проводя измерение оптической плотности (О.П.) раствора в каждой лунке на спектрофотометре (ридере) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм.

На первом этапе вычисляют показатель О.П. каждой испытуемой и контрольной пробы.

Результаты считают достоверными, если О.П. положительного контроля ≥ 0.4, а О.П. отрицательного контроля ≤0.2.

Реакцию оценивают по отношению значения О.П. испытуемой пробы (S) к значению О.П. положительного контроля (Р) по формуле:

S/P = О.П. испытуемой пробы × 100/О.П. положительного контроля

Пробу считают положительной, если значение S/P > 48%; если значение S/P < 48% – проба считается отрицательной.

При отсутствии ридера проводят визуальный учет результатов реакции по появлению окраски образовавшегося реакционного продукта по сравнению с контролями от коричневого до светло-коричневого цвета:

• интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание – положительный результат;
• светло-коричневое окрашивание – сомнительный результат;
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля – отрицательный результат.
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля – отрицательный результат.

ÈÔÀ äèàãíîñòèêà âèðóñíîé äèàðåè

ÈÔÀ Â ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÅ ÂÈÐÓÑÍÎÉ ÄÈÀÐÅÈ

È.Í.ÌÀÒÂÅÅÂÀ ÂÍÈÒÈÁÏ

æóðíàë “Âåòåðèíàðèÿ” ¹6 2007

Ìåòîä îïðåäåëåíèÿ àíòèãåíîâ è àíòèòåë ñ ïîìîùüþ èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà (ÈÔÀ) ïðè îïòèìàëüíîì ñîîòíîøåíèè ñåáåñòîèìîñòè è ÷óâñòâèòåëüíîñòè – äåéñòâåííûé èíñòðóìåíò â âåòåðèíàðíîé ëàáîðàòîðíîé ïðàêòèêå.

ÈÔÀ ìîæíî èñïîëüçîâàòü äëÿ âûÿâëåíèÿ ïðàêòè÷åñêè ëþáîé èììóíîðåàêòèâíîé ìîëåêóëû. Ïðåèìóùåñòâà åãî â òîì, ÷òî îí íå çàâèñèò îò êëåòî÷íûõ êóëüòóð, ïðèìåíèì äëÿ ìàññîâîãî ñêðèíèíãà, ðåçóëüòàòû ìîæíî ïîëó÷èòü â òå÷åíèå íåñêîëüêèõ ÷àñîâ. Ñðåäè ðàçíîîáðàçíûõ âàðèàíòîâ äàííîãî ñïîñîáà ÷àñòî ïðèìåíÿþò íåïðÿìîé ìåòîä ÈÔÀ, ãäå àíòèãåí âîçáóäèòåëÿ âèðóñíîé äèàðåè – áîëåçíè ñëèçèñòûõ îáîëî÷åê (ÂÄ-ÁÑ) ìîáèëèçóåòñÿ íà ïîëèñòèðîëîâîì íîñèòåëå è âçàèìîäåéñòâóåò ñî ñïåöèôè÷åñêèìè àíòèòåëàìè, êîòîðûå
çàòåì âûÿâëÿþò ñ ïîìîùüþ êîíúþãèðîâàííûõ ñ ôåðìåíòîì àíòèãëîáóëèíîâ è õðîìîãåííîãî ñóáñòðàòà. Ñïåöèôè÷íîñòü ýòîé òåñò-ñèñòåìû îïðåäåëÿåòñÿ âûáîðîì àíòèãåíà, êîòîðûé ìîæåò áûòü î÷èùåííûì âèðóñîì [4, 6], äåòåðãèðîâàííûì ýêñòðàêòîì êóëüòóðû êëåòîê, èíôèöèðîâàííîé âèðóñîì ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ [1, 8], ëèáî ðåêîìáèíàíòíûìè âèðóñíûìè ïðîòåèíàìè, ïðîäóöèðîâàííûìè â áàêòåðèàëüíûõ êëåòêàõ [9]. Äðóãîé ðàñïðîñòðàíåííûé âàðèàíò -êîíêóðåíòíûé ÈÔÀ, ãäå âèðóññïåöèôè÷åñêèå àíòèòåëà â èññëåäóåìîé ñûâîðîòêå êîíêóðèðóþò èëè áëîêèðóþò êîíúþãèðîâàííûå
âèðóññïåöèôè÷åñêèå àíòèòåëà, ÷òî ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ èíòåíñèâíîñòè îêðàøèâàíèÿ ïîëîæèòåëüíîãî îáðàçöà [12]. Ðàçðàáîòàíî çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî âàðèàíòîâ ÈÔÀ äëÿ âûÿâëåíèÿ àíòèãåíîâ âèðóñà ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ ñ ïðèìåíåíèåì âûñîêîñïåöèôè÷íûõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë (ÌÊÀÙ13, 14, 16].

Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë ê âèðóñó ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ â ñûâîðîòêå è ïëàçìå êðîâè, ïðîáàõ ìîëîêà J.I. Kramps et al. (1999) ðàçðàáîòàëè áëîêèðóþùèé âàðèàíò ÈÔÀ (“Ceditest”) ñ èñïîëüçîâàíèåì 2 ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë, íàïðàâëåííûõ ïðîòèâ âûñîêîêîíñåðâàòèâíîãî ýïèòîïà íåñòðóêòóðíîãî ïðîòåèíà NS3.

Ñïåöèôè÷åñêèå àíòèòåëà ê âèðóñó ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ êëàññèôèöèðóþò íà 2 ãðóïïû: ïåðâàÿ -àíòèòåëà ê âèðóñíûì ãëèêîïðîòåèíàì, ãëàâíûì îáðàçîì Å2 èëè äð 53, êîòîðûå áëîêèðóþò èíôåêöèîííîñòü è íåéòðàëèçóþò âèðóñ ÂÄ-ÁÑ.

Îíè ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþò ñî ìíîãèìè øòàììàìè ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ [5]; âòîðàÿ – àíòèòåëà ê èììóíîãåííîìó íåñòðóêòóðíîìó âèðóñíîìó ïðîòåèíó NS 2 – 3 (ð125) – î÷åíü âàæíîìó äëÿ âíóòðèêëåòî÷íîé ðåïëèêàöèè âèðóñà. Àíòèòåëà ê íåìó íå íåéòðàëèçóþò âèðóñ, íî èõ ìîæíî îïðåäåëèòü ðàçíûìè ñåðîëîãè÷åñêèìè òåñòàìè ( V. Moenning, 1991).

Èñïîëüçîâàíèå ÈÔÀ äëÿ èññëåäîâàíèÿ ñáîðíûõ ïðîá ìîëîêà ïîçâîëÿåò çíà÷èòåëüíî ñíèçèòü çàòðàòû íà ïðîâåäåíèå îçäîðîâèòåëüíûõ ìåðîïðèÿòèé. Êîíòðîëü ïðîòèâîâèðóñíûõ àíòèòåë â ñáîðíûõ ïðîáàõ ìîëîêà êîðîâ, íåâàêöèíèðîâàííûõ ïðîòèâ ÂÄ-ÁÑ, äàåò èíôîðìàöèþ îá èíôèöèðîâàííîå™ âèðóñîì ÂÄ-ÁÑ ñòàäà è ïðèñóòñòâèè â íåì ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûõ æèâîòíûõ (R. Niskanen, 1989, 1993; S. Alenius et al., 1997; V. Bitsch et al.,1997;S. Waageetal., 1997; J. Kramps, 1999). Äàííûé òåñò óäîáåí ïðè äëèòåëüíîì
íàáëþäåíèè ýà áëàãîïîëó÷íûìè ñòàäàìè, íàõîäÿùèìèñÿ â àðåàëå èíôåêöèè, à ïîÿâëåíèå â íèõ ñåðî-ïîçèòèâíûõ êîðîâ ïîçâîëÿåò ïðèíèìàòü ñðî÷íûå ìåðû ïî ëèêâèäàöèè èíôåêöèè.

Òåõíèêà àìïëèôèêàöèè in vitro òàêæå ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà äëÿ äåòåêöèè âèðóñíîé íóêëåèíîâîé êèñëîòû â ïðîáàõ ìîëîêà (G. Radwan, 1995; T.W. Drew, 1999). Äàííûé òåñò ïðèãîäåí äëÿ ïîèñêà â ñòàäàõ ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûõ æèâîòíûõ, âàêöèíèðîâàííûõ ïðîòèâ ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ, îäíàêî íå âñå îíè â ìîìåíò ïðîâåäåíèÿ èññëåäîâàíèÿ ëàêòèðóþò, ïîýòîìó ìåòîä èìååò òîëüêî âñïîìîãàòåëüíîå ýïèäåìèîëîãè÷åñêîå çíà÷åíèå.

Äèàãíîç íà ïåðñèñòåíòíóþ èíôåêöèþ âèðóñîì ÂÄ-ÁÑ ÊÐÑ ñ÷èòàþò ïîäòâåðæäåííûì ïðè ïîâòîðíîì âûäåëåíèè âèðóñà â îáðàçöàõ áåç ñåðîêîíâåðñèè ÷åðåç 3-4 íåä. Ó æèâîòíûõ ñ îñòðîé èíôåêöèåé ÂÄ-ÁÑ òèòð âèðóñà â êðîâè áûë îáû÷íî íèçêèé è ðåãèñòðèðîâàëè åãî íåïðîäîëæèòåëüíîå âðåìÿ. Àíòèòåëà â ñûâîðîòêå êðîâè æèâîòíûõ, ïåðåíåñøèõ îñòðóþ èíôåêöèþ ÂÄ-ÁÑ, îïðåäåëÿëè â òå÷åíèå ãîäà [8].

Ðåçóëüòàòû ñåðîëîãè÷åñêîãî ìîíèòîðèíãà, ïðîâåäåííîãî ìåòîäîì ÈÔÀ ó ðàçíûõ âîçðàñòíûõ ãðóïï æèâîòíûõ, äàþò èíôîðìàöèþ îá èíôèöèðîâàííîñòè ñòàäà. Êîñâåííûì ïîäòâåðæäåíèåì ïåðñèñòåíòíîé èíôåêöèè ó æèâîòíîãî ìîæåò ñëóæèòü îòñóòñòâèå àíòèòåë ïðîòèâ âèðóñà ÂÄ ÊÐÑ ïðè âûñîêèõ òèòðàõ àíòèòåë ó æèâîòíûõ, êîíòàêòèðóþùèõ ñ äàííûì èíäèâèäóìîì. Åñëè ïðè ïðîâåðêå ñûâîðîòêè êðîâè, âçÿòîé ÷åðåç 3-4 íåä, îáíàðóæèëè âûñîêèé òèòð àíòèòåë, òî ýòî ñâèäåòåëüñòâóåò î ïèêîâîé ôàçå èíôåêöèè.

Âûäåëÿþò 5 ôàç â èíôåêöèîííîì öèêëå ðàçâèòèÿ áîëåçíè (ñì. òàáëèöó). Êîíòðîëèðóÿ òèòðû àíòèòåë â ñûâîðîòêå êðîâè ìîëîäûõ

Õàðàêòåðèñòèêà ôàç èíôåêöèîííîãî öèêëà ðàçâèòèÿ ÂÄ-ÁÑ êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà

Ôàçà        Êðàòêàÿ õàðàêòåðèñòèêà

À    Íåäàâíî èíôèöèðîâàííîå ñòàäî áåç ïðèñóòñòâèÿ ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûõ æèâîòíûõ, òîëüêî íåçíà÷èòåëüíûé ïðîöåíò îñîáåé ìîæåò áûòü ñåðîïîçèòèâåí

     Èíôèöèðîâàííîå ñòàäî ñ ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûìè òåëÿòàìè ìîëîæå 3-4-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà, ìíîãèå æèâîòíûå ïåðåíîñÿò îñòðóþ èíôåêöèþ

Ñ    Èíôèöèðîâàííîå ñòàäî ñ ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûìè òåëÿòàìè ñòàðøå 3-4-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà, áîëåå ÷åì 90 % æèâîòíûõ ñåðîïîçèòèâíû

Ä    Ðàíåå èíôèöèðîâàííîå âèðóñîì ñòàäî, íî ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûå æèâîòíûå ê ýòîìó âðåìåíè óæå ìîãóò áûòü óäàëåíû èç ñòàäà. Ìîëîäûå æèâîòíûå íå èìåþò àíòèòåë ê âèðóñó ÂÄ-ÁÑ, òàê êàê äî 6-8-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà îñâîáîæäàþòñÿ îò êîëîñòðàïüíûõ àíòèòåë ê âèðóñó. Âçðîñëûå êîðîâû îñòàþòñÿ ñåðîïîçèòèâíûìè

Å     Ðàíåå èíôèöèðîâàííîå ñòàäî, åñëè ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûå æèâîòíûå óäàëåíû íåñêîëüêî ëåò íàçàä. Âñå ìîëîäûå æèâîòíûå (êðîìå òåëÿò ñ êîëîñòðàëüíûìè àíòèòåëàìè ê äàííîìó âèðóñó), è ìíîãèå ìîëîäûå êîðîâû íå èìåþò ïðîòèâîâèðóñíûõ àíòèòåë æèâîòíûõ ìåòîäîì ÈÔÀ, ìîæíî ïðîãíîçèðîâàòü ïðèñóòñòâèå èëè îòñóòñòâèå ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûõ âèðóñîì ÂÄ-ÁÑ æèâîòíûõ. Äëÿ ôàç Ñ, Ä è Å èíôåêöèîííîãî öèêëà ðàçâèòèÿ áîëåçíè õàðàêòåðíî, ÷òî áîëüøèíñòâî ïðîá ñûâîðîòêè êðîâè
ñåðîïîçèòèâíû èëè ñåðîíåãàòèâíû, à äëÿ ôàç À è  – î÷åíü íåçíà÷èòåëüíîå èõ êîëè÷åñòâî ñåðîïîçèòèâíû [7].

Ò. Sandvik (1999) ïîñëå òåñòèðîâàíèÿ ñûâîðîòêè êðîâè íåâàêöèíèðîâàííûõ æèâîòíûõ â ÈÔÀ íà íàëè÷èå àíòèòåë è àíòèãåíîâ âèðóñà ÂÄ-ÁÑ, ðàñïðåäåëÿë èõ íà ñëåäóþùèå êàòåãîðèè: êëèíè÷åñêè çäîðîâûå ïåðñèñòåíòíî èíôèöèðîâàííûå (ñòàðøå 2-ìåñÿ÷íîãî âîçðàñòà áûëè âñåãäà ñåðîíåãàòèâíû è èìåëè ïîñòîÿííî âûñîêèé óðîâåíü âèðóñà â êðîâè, ñëþíå, ôåêàëèÿõ, ìî÷å); æèâîòíûå ñ îñòðîé èíôåêöèåé (íåïðîäîëæèòåëüíîå âðåìÿ èìåëè íèçêèé òèòð âèðóñà ÂÄ-ÁÑ â êðîâè) è ò. ï.

Çàêëþ÷åíèå. Ñåðîëîãè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ ñûâîðîòîê êðîâè, ìîëîêà èëè ìîëîçèâà æèâîòíûõ ìåòîäîì ÈÔÀ ïîçâîëÿþò áîëåå ðàöèîíàëüíî è íàäåæíî îðãàíèçîâàòü ðàáîòó ïî ïðîôèëàêòèêå è îçäîðîâëåíèþ ñòàä îò äàííîé èíôåêöèè. Õîòÿ äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ äèàãíîçà íà ÂÄ-ÁÑ òðåáóþòñÿ: èçîëÿöèÿ âèðóñà â êóëüòóðå êëåòîê, ìåòîä ÏÖÐ äëÿ âûÿâëåíèÿ ãåíîìà âèðóñà â áèîëîãè÷åñêèõ æèäêîñòÿõ è ò.ä.

æóðíàë “Âåòåðèíàðèÿ” ¹6 2007

Ðåêëàìà íà ñàéòå

,Âe_
—“~9|m¸€kú†p!“0#…ë´WûÊÇ]¾„°wxt|rò[¿M«¯g{‡Óñp9ˆî» .EŠSäLØ”r*—Πˆ8RӉBz-”Ï­Ô…æ¹ARÉ­r‡tVÂÚçäáve|aTnÁ;ÄÆcA‡Ižd,#ñcïrdz DB4B2:¤ÅCÀ°ŽÿÐcAwNqU@#T 5èd°‰t@6̃-²ÚK̓¶Àš¹à–û ö”Š&à›Ñœ‘Ã-˜×x^©s°4Z‡:ìAæVH´ï`”Ç˜bàëttvÜžÁõg“¿§STÑ5ýxv|QÞgsèeÇ× Â¸ñ stc6¡HÊe„wÕ ‚;Oõ òLH– †ÌºòA
_2rnãÞ§EŠámHvMP1Ö¤Kؔ.›én‘)ƽdŠÚ†ãQÑòOq-(ÐÿP[ca«guM¢í[s¤Ê ö@+ îˆ@,ùÝ&‘ª„mÀ8TxªÑ±EŸÁ ¸Æ,Üõc%§ãìõO£’¿°E”9-ÕnJ5㠚
úè¬û7àmgʇ+”/„ë8_mÇùFÿÎ—î­ †ï7‚ØnäüsR´eµ ÊÞΡ,ßDú`zãš2…Ï$KG8A½2>ð³ )u +¶°®2©®“5¶;—i4‘6>Åäå†ö@è8ÎXÕÒÓᒼ
Îõ v…,€÷¨ `^Ä·!8*Äãy u8‚âvÇësRJhZÃa
ÎÀQVyztCG^ÔÐKR‡oZ4SÃ|’µÕ…P”WTëTÈ=êù¹sè×UïF¢¼´>W!ÕDÚrÚ6½ûœÜ@Õ`¥HF_¡NѾ5ò×ÆMpj#oD¿P
ƒ¯,J
ùŠŒ#_Q;÷3ù‰À渎>”V±Bááb}L>ÅXœ&8%ù—úˆcp ž’&:Вá(ÆT3èÑä0ZZÝ9/¶Éñt9ˆN‹÷r,Å6`®s‰,ÖÓ°KAŸì « »ä—™…7eÉw•×Ø]*¯q[W^ã—*oøQåMV®)½–ïTzÝÖ¥÷ÿÄZ© ƒ«æ¥ò’pÕ¢$þBºZ-Å¿ˆ·~×]Ë·•¯Ê·œ_ÙÌvåÛª—ò݁:p³tYÖ⍘&Öên_|éö•ðÛÔåxÛ+²RË-kæWd½zýªÏ;Å;»ÙüÇÅØnéeûÚËÎðeæXñ2>-¼lÖ3Wñ®é$Ê_3‡[ËGpôMSoyhN«7qF¼¦¬ÿ)¾öø:7hçÀøÕÀhÓÆm˜îR÷¯ pHs

endstream
endobj
24526 0 obj
>stream
xœ}’Ënƒ0E÷|…—é”Â6¤m$d HXô¡Ò®ª.ˆ=¤HÅX†,øûúÒ&U±Ö̜¹Ã
órWÊvDá³îy#jZ)4ýIs@8¶2 [$Z>Α{ó®VAhš«i¡+eÓI‚ÂSF=¡U*úÜᓠ[yD«·¼2quRê:#ÂcH@c„jõXw€B׶.…©·ã´6=?Äë¤ Q?ïªæ ky„ Áf1”f± ¤¸ªÏ]‡†ÖÚё¡1¦ØÑsþLýˆ#ÄÓùLÿ#Jv‹ÒeÑ4uXš1ô>ïfË2ö±¤Nb;2ÝäÅ¢:ÙßY9Rìí¼82u_
Çtû[”^‹RL-Fqì錹ä­On}²¸8)úsRî°hã{Ý»ˆxÝh·x5JÜÕ(ñƗW³?Ýzóì(~ÒژÉعÈú§•pö¸ê•í²Ï7¯ûë6
endstream
endobj
24527 0 obj
>stream
xœ}RËnƒ0¼ó>¦‡l%BÂ$‘8ô¡Òžª,)R1ȐCþ¾ön’6©TK°šñîÎØ^7/օêfæ>ë¡.afm§
ÓpÐ5°ì;åð5]=Ÿþë¾×—Çi†¾Píà$ s_Ìæ4ë#[dÍ°ƒ;Ç}Ò
èNíÙâ-/
.ãø=¨™yNš²ZÓè¡«˜‹eË¢1ûÝ|ššŸŒ×ãL æd¦˜Æª]©=8‰gVʒ­Y©ª¹Ù©j×þ¤û&݄ƒðR$cD|Cdˆ¤åN$¥øk”%’e†DFœ5£³…ú³Ò6;&’¤c‰(Û²-ÑJàÞ:&D&%¹[‘™Ä°»øsÜ,£öæï6’š´Ax”J?l’$é#Ëý+ÿüÆ?0-Ì·ÿ*óͽmÊÍ»˜paK
y¥$n”„ÀAˆW/üï†G¿uí“ÛɼÌS}ÐڌŽ/ΐžNÁeÂÇa´Uöû>pÛZ
endstream
endobj
24528 0 obj
>stream
H‰œWÉnÛ0½ð?ð(Ds_ C€7- mÜSÒC¸F€Öh¶ùýÎP²Eɒ-ÄEô›™7ä„L>’étr»x·$lòáq·%Éf—}¹KóœÌ—2_G“‚O•#ëïã’þ8’2EƒdýÝÜY²}Ù†‘«F7ãÑ}BÒ¯dý~

cs–ã‹Ö^ZÔ!øêÓ¡µá“Ž£«?lÜy´r€r•3x ÖQ®&©)HòMÂ-…9çªÞ™À.ÈØ;*LìéŒë›…SÝú¨T&>ÍT¢ñõ’Ô$&ÕðÀPè ì9|‘;Ö÷p,œ!穾ûõ¸;²­û
€6ß”X¹šïä5ͼ,zÇvâ8êLç8ÝÁóÜ@gŸr–ü@ÊS®’o/›”ËdÿßÏ8ý™Ø°î:¬+ã©1×Eá»p¬ 2†Áë¥ WÕþïÙj‹uÁ9Ahdö(œŽð´YÃi¨½é¨-3ݧý)¢èp³1P uîµSÙâ°0¢úAžlC0t?T.Ò
éڈ‚hÌ ÛÊTëï òßÑ©£•iªJ¾ÀèÎ8áNxm[ùÔeÈ·
Á}ÐúŸD>TJ f­c3š+áÑÌÕe-à”TíXM”5ýëpW„«wY•¹X2䍎t4½”
n{y©xg#çð8¯u_ää¿
(Âo
endstream
endobj
24529 0 obj
>stream
H‰ÄVM‹Û0½ütl«hFßoRZXh‹oKO…öÔC÷²¿ã‘ÜÄñ&±Aے(ÂÑÌ%A{AŸˆüiÅó϶™ï~ýÐ6O[û]ú&úOm³ïÛæKÛün›­6# ˆþGۀPô„µ(­ý¯¶AÑ?ÓiFñòZË¡‡¥¢¾S¨Ý«yü
®ƒ®Vô§wâýÒª–>TLÕªHŽÉmËÒ’;,ÉpZzÞuå’BÐ]E­‘¡Úý¬@m”^×Dhàà €
؆/_`‰Ió.#–#¤=Jˆÿ!í½„zWÃL¡jCºcº„‚XǸ¨]Ɔiæ›åQu ¼|;|Äþ±bóYl·›Çîãƒ@HIì:q­ûPj{p•DG™QtB¥ôbñ³^jS+&9›#¥ý‘ì·%1J:»VJ+^I*cÁÝ’ÀQ‰ÞJLqTM½¿H]/¯ý­œÔP—•Ï’@µË›÷y, cpò@¼ŽOp,CÿŸRéºødQ˅ni3M@„·R•[}khPûjÑÈ,™ˆGÒiR|%ç$¦ÍOÑçbmɞéAå9á´.m¬ÛË¢ÍI®|sxæAIó‚040c·ÖïšSÉÏQÜ,
ñÃN¢L3¿”Í?ùÅ;˜tǒæÙÛ©0:¶,Ó 4¹ …2žŸ6(Èlé’ŸzŸ52ïR#€=*g6³ªç×G¼ÔzuÕHUÛY¢¤UÙqœÏ±KÁ½Üëêà>J˜£G·˜ÇªÉ°„쮋´fû˜å3²š0²eóþ0s ò½
náp»Žâ1×Ö¡©|£g Ɓ$YåŠøWŒ”Šø#À TP«
endstream
endobj
24530 0 obj
>stream
H‰´V=Û0Ýä?hl+”)Zh¾-p@[d;t: 7uhÿÿPJVlËΝm´‡Àv‹äùôÈë—íæ|Ýnr2òeÓ䕵¨‘Õõ×vó´7hŽÍu½·èÎr°
G«‹A¬G–»+@uý9pB¨ÉN>¨c3;5cÍElUmâªç§6¼1ô
p`§²è´Ï¶&›ËunlÞ ø´rASqï˜ÛVq%|Š¯å”¬ÎØ6uviÄbSaü}l*¿:҆ð2Èim ö ¤Ø˜s~†ù”“”ÙÐ0€Q/ñö0N¾:?•Ú}Uûýîñøù¤›FNGus´õ…sÀH6nbZϩ˺p9©tvH!h“Ñj §äŽ˜î¬þ¼Üû÷ûCJØq¦w—z…êȧA”E4l™4ÄÖgR”_êTs¸œäró•o´sëQx+Ô/Ì
¦Âù”ñ
ů`»´åÕ0A×á*ÙZÅá!Çp-hJÈÕȶŽ4eîxrØBwÀˆåTÏcó^»°>ã1WõE—é+Ñ¸žR$ÚÎSJ
0øê
Á3nðo›@yÎõ ÍkgiFBÜ@Bºô‘6V¼Êc™ù9òÚԊj’ô}GbE”5:4ÀVêP[’|®n‚̤Ж/7©y:›:¦t-Dñ¯‰†f+:¶€ÔPl°kÙ&4˜~ðHÝ8dþsϵEÃN»•WԶᔄº]ÁíɒvJqá©7Ȅç¶éƎHɧß÷Ý=ºµ··s?$l7Ì9ޒbE•_w‹”#X˜µ2½ŠTõL´{íëHâÒÂ.›y°¹íñͲ†G V·G–Q€G‡cÈ3YMõ„yqpynO‡´Å=†­ÓÖNI8£+aáÈDL±}Nû{»ùvÇ1™eƒùxîÞ{p꣬¬Õ”ü֔|›y
ÿ2@Ò¾ô·h€0>Í#¾ùŸóCܕ)F¶Ip;3õW€ ïñ³M
endstream
endobj
24531 0 obj
>stream
H‰¼WK‹Û0¾òtÜ=XьÞyØKKJ›ž–JisêúÿÕˍműRØd#Ù3óÍ|óÉêeːí]#ü!*Æw_Ééýz՞֫½_@˜ÿA-©Â¹¡œ“Ó¯õ*˜ƒô.Œ¿§‚7í¢3í×ÎñprLþÙ!ÇN†m¹Æ͇äÂRk‡!IÃ(†œ¾ûàÐît³ÆJRáõÇÙ®›Øl:I ÉéçÀsªå(Ýò85¥™š@~Iن,eªP#uÈÃTÖÎd#S.
¿z9vjY“ˆàH¥)èVdO°t ©ƒâÑÎA m­³ÛÁK¶©‘ôþŠc¨QW€öm¶¬zê¾ED’å#ߌœÃåi
Ž´ÏB6Év»y>¼;Αýñ@zז†¾8÷Œ2Ï
jì•tK8òXў1f©Ì`)pMü1^%ù}¾vúé)
ÄTK›NQ¸Š}q‰RÅHMõÈÊÇëúæ0Ø Y@çý.v˜Q#E6y”z6ýxYd¹¤î†Žž}_¤1öÉܬ.öþàÒR͋ྈ®á ¾²Ÿ$‡ôhÜísن!íð ‚IOlt#ÇC,;ü „˜®‰„eQu郿-†ýáƼ 1M6”èÔäñƒ¹Qú†©™.ºGµ–ù’–³öÐ*ÊT•˜Åæ÷×3yøñÚ|ùüX¥l4Ìk荅} r‡®Fo(번rÂËuÁÏ¥TúS·yȓ`”íü (Ýë¸iDÔÃ5pÓ옐£¢¡;ú¥oµp
R=„[­’Áæ›ÿ†¸”¦X%.ÿ . Ô¾¹¸þ¹G£ÿ).uâšI©ôÇëÄ5Ìöq Q’®j¸²N#rÚδÿj ½).¡–Ä%(V£^úZó“? ì¾w
endstream
endobj
24532 0 obj
>stream
H‰´VMoÛH½ð˜cRÀÉÎ`¨ÝºèbÛôTìa±Ø¦‡´‡þÿC9r$ÙR”Ô€£’Ͷ›»“˜.š‡oÛ
Ô?2Ä l4l#8o~l7_oÌíßæáíæ½n2ïïÆÜ}2ûýÝýñã;ãâݟÿü|47ÿýÜ}ù|Ûuæðîh…ß)ÝUv¶@…l0úË~Åüz¼v÷¯šÈÉÙî9—Ä_±dd¬`.5 †›4ÚI1″3êÿcç÷ÈÄz:’}}DÒåû¡Üwù2ÕÛØn“ëòj’B²de¹’ÓÙ[`švÁ’¸|ì=8k>Â؜6üVŸ:ŠÃµ©šb÷Em5çô’¡e¹ÖØazhrm˜/çùš¨yLàWÕ¼ØUeNɁý¿Ëü9È+Ê|°)—9w;ޟëw¶¬»ÔʸU5å†à¶™ð”å˶Q^›2ۘÆ93ùÚTµËe

 eV’݀¾²Ø!Yç(zD² ªôœ`©û¸(‘œ8ªq’–ÆŒÙ.°„ìÖ«ˆåEkƒi=P…ƒI){}M…®x›Ã~ nmÄ2d+åÔ©n_7VÒÖC²ôÉb-ð–Ðã´D•jI5ÏzFœæC¥îx ýUu6!ïq€
‡U›ó-ñ’]žˆ·jsUºªÃ0®Ä?¤äPˉS–nØ=Üí57Uh}¹Æ¤‰Ù›RÚtõ8:vmêS°€®(^}>CM¾dñtm»S1æ ÚS6œ$Íèi2«Å¢ØÖ¯1¾Wú4uÞêr¾%œöÉì¥GýyIÞ(ƒ¢ÍÐS¨ÛnƒdeÁ.RõngN°k?—µ:Ì”o²˜2oɘ
[÷@}ÇL¢ˆú,CÑW·ywÁ¢ŸýŒ@ÿ›Ÿ€By¹çÊ_]v”É¡/f¦+‡uƒÝ*ç@Ç.«½Ye+S¶¤Ú‚Ûq>êWö×XýUv†»4dÖ³#îθǪNVÃ~­›’JÑþŒT}[еOhÿv•S2Dž¤Ï£¯Îfpk°„ë¶{Òqùëcè^Úл‘Oø/À ër¡Ú
endstream
endobj
24534 0 obj
>stream
H‰|W¹Ž9̘è؁¬‹¤x¼Áö’v±_âÿ,ñ’ºß‘†lIdU‘”ÞÇÇןŸÿ8}ûv|ÿñy¤ÒB?¨çÐò1þ)…Çïßßþûòþvüõóó8¾þs|ØÆfk
t´ˆ!çãöþ–JÌñKã䙝a80€9†¡êòæך~Äêÿ]ì§`¦>;Ò)ƒi·X,„B¸Ú†àÿgtã òH©ÅºpP[@0ŸØùÄh9Ct¸¾;’:($àœmš#k’À´’¬u„˜ »Û…Y1P•CVc}Ø8,–Ó8°Š#zHà’°4êbÚv‚•ÌrîWÈÂvWÐY@Þ9ªí˜®ŽÄ6yJ2ú÷¢R{N‚œÈÄ6ÚzèâXYf¶•hKêä8i·‰ý¢:zܪcá¾=”&
Š¹Êvö ֝ì(²ãÎQ¬ë@””|¡kñEº¢`^nˆ7¦µ/Ý!mûDë»j0‡p•æiÒهS›]Ób6ê¹kZL[WTî;ðë҈´WؔÛV{ûRӖV/s ÍÊWä%Z$G°’~³Lœ½=JKiÃ$Àê
ãœÀÓa)âÔ¢ÅêՒBôz‘ÙÉ?ï]7ö×sgw¦ÕGêϦ>&nd¯_Ì
°Ê-‘-`‚“£É-3†š¦$Ó½ºH晰ˁkÇi3×Fu”YXÒq4a²­ÍÔNŽ‚mr¹V¢‡L[*!zIJ‡ÌîÀWWv¢£8p‰Ïvw¢«J½˜f۔Á”ßkëU1Ö½ôí+I¦Y÷™Y‡€,|”íYy”§´šŒÑÈk‡öøc™žbÇ­E‹Žt¾À÷.o¬ìRŽ˜„´UÛIék%›#$+6̒dò.Nâțö+©W0Ð`PžJ°¸2Ó±sV`s Ç5É’š6ÈMä$aZ­¦O7ýJ‰o¯V*”M6LTõE¡=MÀv±Ë›ÐÞ(¶@ï{¿#H›ÖŸ‹R:;’lY˜ºlñ·ÖtÈïvßïZۏLÒd–E–ç£ZÒOÑ3ì;ÃÞp„r