Опыты на кишечной палочки

Вопрос о том, существует ли эволюция, давно не волнует ученых. Доказательств так много, что лишь далекие от науки люди продолжают отстаивать идеи креационизма. Одним из основных аргументов является успешное наблюдение эволюционных процессов в лаборатории. Однако цель долговременного эксперимента по эволюции кишечной палочки, E.coli, — не победа в споре над гипотезой разумного замысла, а выявление механизмов развития жизни на Земле. «Лента.ру» рассказывает о новой работе, опубликованной молекулярными биологами в журнале Nature.

Долговременный эксперимент по эволюции E.coli — попытка ученых в экспериментальных условиях наблюдать эволюционные процессы. Может возникнуть вопрос, почему для этих нужд ученые использовали именно кишечную палочку, а не собаку или лошадь? Одна из причин в том, что E.coli очень быстро размножается. Другая особенность, делающая бактерию удобной для исследований, — небольшой размер генома, который позволяет достаточно быстро определить, какие мутации возникают в генах со сменой поколений. Кроме того, E.coli можно без вреда для нее заморозить на длительное время.

Эксперимент под руководством микробиолога и молекулярного генетика Ричарда Ленски из университета штата Мичиган начался 24 февраля 1988 года. Был взят штамм кишечной палочки Bc251, который в рамках исследования назывался «предковым». Из него сделали 12 отдельных популяций, при этом половина из них (Ara−) была неспособна усваивать арабинозу. Каждая популяция получила обозначение: от A+1 до A+6 и от A−1 до A−6. Популяции размножались в искусственных условиях, при этом каждый день часть бактерий переносилась на свежую питательную среду. Через каждые 75 дней (за это время сменялось примерно 500 поколений) бактерии замораживались в глицерине для дальнейших исследований.

Однако эволюционисты занимаются не только установлением фактов возникновения мутаций, они стараются выяснить закономерности эволюции. Например, применяя методы сравнительной геномики, при которых сравниваются геномы различных организмов, можно выявить механизмы, отвечающие за появление полезных приспособлений. Ученых интересует, какая доля мутаций является потенциально полезной. Для ответа на этот вопрос нужно объединить сравнительную геномику с «эволюцией в пробирке». Масштаб задачи станет очевидным, если представить все, что необходимо сделать. Во-первых, нужно проследить за всеми мутациями, которые имели место в течение тысяч поколений. Во-вторых, нужно понять, какие из них были нейтральными, то есть никак не повлияли на выживаемость организма, какие вредными, а какие — полезными. Чтобы это сделать, надо сравнить различные линии организмов с мутациями и без них.

Ученые уже предпринимали попытки провести подобные эксперименты, однако главный недостаток их исследований заключается в том, что они являются относительно кратковременными. В результате можно выяснить, что происходит с адаптациями, лишь на самых ранних этапах их развития, при этом очень трудно отличить драйверные мутации от мутаций-«пассажиров». Можно пояснить это на простом примере. Драйверная мутация, возникшая в определенном гене, усиливает активность кодируемого им белка, что дает организму преимущества в выживании. Этому гену будет благоприятствовать естественный отбор, однако в этом гене могут возникнуть мутации, которые никак не влияют на функции белка. В результате бесполезные изменения будут сохраняться и распространяться, подобно безбилетникам. Нужно много времени и несколько эволюционирующих популяций, чтобы отличить одну мутацию от другой, дождавшись, когда одна из них возникнет в отдельности от другой, и посмотрев, к чему это приведет.

Долговременный эксперимент по эволюции E.coli оказался удобной платформой для того, чтобы решить данную проблему. Ученые под руководством Ричарда Ленски проанализировали полные геномы 264 клонов из 12 популяций, в которых, в конечном итоге, сменилось 50 тысяч поколений. Предварительные результаты продемонстрировали, что приспособленность микроорганизмов, которая определяется как скорость роста популяции, увеличилась на 70 процентов по сравнению с той, что была у предкового штамма.

Молекулярные биологи расшифровали геномы кишечных палочек, принадлежащих поколениям 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000, с помощью метода секвенирования нового поколения. Всего было найдено более 14 тысяч мутаций, которые привели к потере 1,4 процента общего генома. При этом на половину популяций (Ara−1, Ara−2, Ara−3, Ara−4, Ara+3 и Ara+6) приходилось 96,5 процента точечных мутаций (мутаций, затрагивающих один нуклеотид). Это объясняется тем, что некоторые изменения в генах привели к нарушению процессов восстановления поврежденной ДНК, в результате чего скорость мутирования у этих штаммов значительно повысилась. Склонность к мутациям также придавали IS-элементы (Insertion Sequence) — короткие фрагменты ДНК, которые способны перемещаться и размножаться внутри генома, не выполняя никакую полезную функцию. Например, в популяции Ara+1 31,8 процента мутаций представляли собой вставки IS-элементов, а у популяции Ara−5 (поколение 30 000) доля этого же типа мутации достигала 38,7 процента.

Ученые отмечают, что склонность к генетическим изменениям лишь незначительно повышала приспособляемость организма, поскольку в то же время увеличивалось число не только полезных, но и вредных мутаций. В гипермутированных E.coli отличить полезные генетические изменения от моря остальных мутаций (нейтральных и негативных) становится очень затруднительно. Поэтому исследователи обратили свое внимание на популяции, где скорость генетических изменений осталась на предковом уровне. На основе данных они построили модель зависимости между временем и числом полезных мутаций, которая позволяла точно предсказать уровень приспособленности у микроорганизмов из поколения 50 000. Чтобы снизить влияние статистической неопределенности, биологи обратились к дополнительным доказательствам.

Во-первых, так как нейтральные мутации не оказывают никакого влияния на приспособляемость, на них не действует естественный отбор, поэтому скорость их накопления должна быть сравнима с общей частотой мутаций. К таким генетическим изменениям, в частности, относят синонимичные замены, при которых изменение одного нуклеотида в гене на другой не приводит к замене аминокислоты в белке. Ученые рассчитали, во сколько раз несинонимичные мутации накапливаются быстрее, чем синонимичные. Результаты показали, что после 500-го поколения скорость была больше в 17,1 раза, а после 50 000-го — в 3,4 раза. Это говорит о том, что большинство несинонимичных мутаций были полезными и повышали приспособляемость организмов.

Исследователи также выяснили, что большинство мутаций, произошедших в ранних поколениях, были драйверными и оказывались полезными для кишечной палочки. С течением времени их доля снижалась, однако они не пропадали полностью.

Авторы статьи подчеркивают, что штаммы E. coli, участвующие в долговременном эксперименте, могут отличаться от многих природных популяций в важных аспектах, включая низкую частоту мутаций, отсутствие полового размножения и стабильные условия окружающей среды. Эффекты, которые могут накладывать неучтенные факторы на скорость накопления различных видов мутаций, должны быть учтены в будущих экспериментах.

Источник

Открытие CRISPR, как и все гениальное в науке, было сделано почти случайно. В 1987 году японские ученые из Университета Осаки секвенировали ген iap кишечной палочки, изучили его белковые продукты и, поскольку ResearchGate тогда еще не было, честно написали в разделе «Обсуждения» следующее: коллеги, на 3′-конце нашего гена — какие-то странные повторяющиеся последовательности по 29 нуклеотидов, между ними — не повторяющиеся, по 32, глубокий биологический смысл от нас пока ускользает.

Спустя несколько лет испанец Франсиско Мохика из Университета Аликанте, секвенируя для докторской геном архей-галофилов, обратил внимание, что и у них в ДНК есть множество коротких повторяющихся последовательностей, которые перемежаются неповторяющимися (правда, эти последовательности отличались от тех, что японцы нашли у эшерихий) и предположил, что они каким-то образом регулируют экспрессию генов.

В лихие девяностые, с развитием технологий секвенирования, ученые по всему миру начали играть с геномами и — сюрприз! — прокариоты, от гемофильной палочки до чумной, раз за разом выдавали в геноме одну и ту же структуру: короткие палиндромные повторы, перемежающиеся вставками (спейсерами), которые каждая научная группа называла как душе угодно: кто — SRSRs (short regularly spaced repeats), кто — SPIDRs (spacers interspersed direct repeats), а кто-то даже LCTRs (large cluster of tandem repeats). Наконец, мировое научное сообщество сошлось на CRISPR.

Группа голландских ученых, к 2002 году насеквенировав массу геномов прокариот, обратила внимание, что к CRISPR всегда прилегает однотипная группа генов. Глубокий биологический смысл опять ускользал, поэтому гены окрестили просто: Cas — CRISPR-associated.

База данных с последовательностями ДНК расширялась. В 2005 году все тот же Франсиско Мохика обнаружил совпадение одного из спейсеров кишечной палочки и фрагмента ДНК бактериофага P1, и практически одновременно две группы французских ученых обнаружили совпадение фрагментов ДНК других фагов и спейсеров чумной палочки и нескольких стрептококковых штаммов. Родилась гипотеза: система CRISPR-cas связана с приобретенным иммунитетом прокариот. Проверить ее было нетрудно: культуры микроорганизмов заражали фагами, а затем искали в геноме новые спейсеры. Гипотеза подтвердилась. Началась эра CRISPR.

Далее события развивались стремительно: пять лет прошли под лозунгом «хотим делать так же in vitro, а потом на эукариотах in vivo». Итак, к 2010 году были обнаружены особым образом процессируемая CRISPR-РНК (crРНК) и молекула-активатор tracrРНК, обеспечивающая этот процессинг, а также открыта функция белков Cas — нуклеаз, разрезающих мишень, которая связалась с направляющим комплексом crРНК и tracrРНК). Этот мини-набор юного генного инженера (crРНК–tracrРНК–Cas9) позволил группе литовских ученых в 2011 году перенести CRISPR-систему из стрептококка в кишечную палочку. Вскоре система была упрощена соединением crРНК и tracrРНК в одну молекулу, названную sgРНК, а уже к 2013 группой Чжана Фэна была опубликована одна из наиболее цитируемых статей, посвященных CRISPR, описывающая редактирование генома эукариот: эксперименты проводились на клетках нейробластомы мыши и клеточной линии эмбриональных почек человека.

Вам тоже уже не терпится начать лечить пациентов? Вперед!

CRISPR может сослужить неплохую службу в терапии ex vivo — на клетках крови. Например, если отключить в гемопоэтических стволовых клетках больных бета-талассемией или серповидноклеточной анемией ген BCL111A, а затем вернуть их в кровоток, то мы тем самым настроим дифференцирующиеся из них эритроциты на синтез фетального вместо дефектного «взрослого» гемоглобина. Фетальный гемоглобин менее стабилен, чем гемоглобин А, но все же выполняет свою функцию куда лучше мутантного белка, а состояние пациентов значительно улучшается, что демонстрируют клинические исследования, запущенные в последние несколько лет в Европе и США.

Кроме того, в настоящее время при помощи технологии CRISPR совершенствуется CAR-T терапия — метод лечения онкозаболеваний аутологичными Т-клетками с химерными антигенными рецепторами: нокаутируя определенные гены в Т-лимфоцитах, можно добиться их большей устойчивости и избирательности.

А если мы хотим лечить непременно in vivo? Что же, у одного из лучших друзей биологов и их самой элегантной модели, червячка C. elegans, в организме около 1000 клеток. А у человека — триллионы. Редактировать и редактировать. А если вы сейчас подумали про эмбрионы, то забудьте: эмбрион вам информированного согласия на исследования не подпишет. Ведь никто и не обещал, что будет легко.

Но не расстраивайтесь, еще не все потеряно. На взрослых животных моделях за последние несколько лет все же удалось сделать немало: повысить экспрессию дистрофина у мышей, свиней и собак с миодистрофией Дюшенна, снизить уровень фенилаланина в крови у мышей с фенилкетонурией, замедлить на мышиных моделях развитие болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза. Да, мы не можем щелкнуть CRISPR-ножницами один раз на стадии зиготы, чтобы убрать смущающую нас мутацию во всех будущих клетках человеческого организма, поэтому при генной терапии in vivo на взрослом организме мы можем ожидать не полного излечения, но снижения прогрессирования заболеваний, смягчения симптомов, улучшения прогноза.

Весной 2020 года в США впервые начались клинические испытания CRISPR-терапии in vivo. Пациенту с амаврозом Лебера 10 типа была проведена внутриглазная инъекция препарата для редактирования точечной мутации в гене СЕР290, вызывающей нарушение функционирования палочек и колбочек. О результатах говорить пока рано, однако исследователи настроены весьма оптимистично. Пожелаем им успехов!

Ishino, Y., Krupovic, M., & Forterre, P. (2018). History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of bacteriology, 200(7), e00580-17. https://doi.org/10.1128/JB.005…
Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., & Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12), 5429–5433. https://doi.org/10.1128/jb.169…
Mojica, F. J., Juez, G., & Rodríguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular microbiology, 9(3), 613–621. https://doi.org/10.1111/j.1365…
Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., & Schouls, L. M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6), 1565–1575. https://doi.org/10.1046/j.1365…
Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., & Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution, 60(2), 174–182. https://doi.org/10.1007/s00239…
Pourcel, C., Salvignol, G., & Vergnaud, G. (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology (Reading, England), 151(Pt 3), 653–663. https://doi.org/10.1099/mic.0….
Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A., & Ehrlich, S. D. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology (Reading, England), 151(Pt 8), 2551–2561. https://doi.org/10.1099/mic.0….
Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39(21), 9275–9282. https://doi.org/10.1093/nar/gk…
Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P. D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L. A., & Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (New York, N.Y.), 339(6121), 819–823. https://doi.org/10.1126/scienc…
González-Romero, E., Martínez-Valiente, C., García-Ruiz, C., Vázquez-Manrique, R. P., Cervera, J., & Sanjuan-Pla, A. (2019). CRISPR to fix bad blood: a new tool in basic and clinical hematology. Haematologica, 104(5), 881–893. https://doi.org/10.3324/haemat…
Li, C., Mei, H., & Hu, Y. (2020). Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy. Briefings in functional genomics, 19(3), 175–182. https://doi.org/10.1093/bfgp/e…
Amoasii, L., Hildyard, J., Li, H., Sanchez-Ortiz, E., Mireault, A., Caballero, D., Harron, R., Stathopoulou, T. R., Massey, C., Shelton, J. M., Bassel-Duby, R., Piercy, R. J., & Olson, E. N. (2018). Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science (New York, N.Y.), 362(6410), 86–91. https://doi.org/10.1126/scienc…
Moretti, A., Fonteyne, L., Giesert, F., Hoppmann, P., Meier, A. B., Bozoglu, T., Baehr, A., Schneider, C. M., Sinnecker, D., Klett, K., Fröhlich, T., Rahman, F. A., Haufe, T., Sun, S., Jurisch, V., Kessler, B., Hinkel, R., Dirschinger, R., Martens, E., Jilek, C., … Kupatt, C. (2020). Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature medicine, 26(2), 207–214. https://doi.org/10.1038/s41591…
El Refaey, M., Xu, L., Gao, Y., Canan, B. D., Adesanya, T., Warner, S. C., Akagi, K., Symer, D. E., Mohler, P. J., Ma, J., Janssen, P., & Han, R. (2017). In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation research, 121(8), 923–929. https://doi.org/10.1161/CIRCRE…
Villiger, L., Grisch-Chan, H. M., Lindsay, H., Ringnalda, F., Pogliano, C. B., Allegri, G., Fingerhut, R., Häberle, J., Matos, J., Robinson, M. D., Thöny, B., & Schwank, G. (2018). Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice. Nature medicine, 24(10), 1519–1525. https://doi.org/10.1038/s41591…
Park, H., Oh, J., Shim, G., Cho, B., Chang, Y., Kim, S., Baek, S., Kim, H., Shin, J., Choi, H., Yoo, J., Kim, J., Jun, W., Lee, M., Lengner, C. J., Oh, Y. K., & Kim, J. (2019). In vivo neuronal gene editing via CRISPR-Cas9 amphiphilic nanocomplexes alleviates deficits in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature neuroscience, 22(4), 524–528. https://doi.org/10.1038/s41593…
Lim, C., Gapinske, M., Brooks, A. K., Woods, W. S., Powell, J. E., Zeballos C, M. A., Winter, J., Perez-Pinera, P., & Gaj, T. (2020). Treatment of a Mouse Model of ALS by In Vivo Base Editing. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 28(4), 1177–1189. https://doi.org/10.1016/j.ymth…
Ledford H. (2020). CRISPR treatment inserted directly into the body for first time. Nature, 579(7798), 185. https://doi.org/10.1038/d41586…

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.

Источник

Микроорганизмы в пищевых продуктах присутствуют всегда. Патогенные микроорганизмы могут быть уничтожены благодаря обработке продуктов. Они могут стремительно размножаться из-за неправильной транспортировки, хранения, приготовления, или подачи. Увеличение количества этих микроорганизмов может привести не только к порче пищи, но и вызвать серьёзное отравление. Распространённый представитель пищевых патогенных бактерий – кишечная палочка. Кишечная палочка является частью микрофлоры кишечника человека и животных.

Некоторые виды кишечных палочек – патогенные для человека, то есть способны вызвать заболевание.

Бактерии группы кишечной палочки – универсальный показатель качества пищевых продуктов. Наличие кишечной палочки – показатель фекального загрязнения, особенно воды.

К сожалению, по внешнему виду, запаху или вкусу мы не сможем сказать, загрязнена ли пища кишечной палочкой (E. coli).

Кишечной палочкой могут быть обсеменены многие продукты, включая говядину, зелень, готовые к употреблению салаты, фрукты, сырое молоко и сырое тесто, нарезки колбас, сыров , особенно в условиях рынка, где не всегда обрабатывается аппарат для нарезки, мясорубки для приготовления фарша. Кишечная палочка активно размножается во время гниения продуктов.

Механизм передачи возбудителя фокально-оральный. Заражение происходит через пищу, воду, грязные руки.

Эта бактерия способна вырабатывать токсины (25 типов) и в зависимости от типа токсина, вырабатываемого кишечной палочкой, она обладают определенным действием.

Например, энтеротоксигенные E.coli имеют высокомолекулярный термолабильный токсин, который действует аналогично холерному, вызывая холероподобную диарею (гастроэнтериты у детей младшего возраста, диарею путешественников и др.).

Энтероинвазивные кишечные палочки вызывают профузную диарею с примесью крови и большим количеством лейкоцитов (аналогично дизентерие).

Энтеропатогенные E.coli вызыают водянистую диарею и выраженное обезвоживание.

Энтерогеморрагические кишечные палочки вызывают диарею с примесью крови.

Симптомы

Симптомы пищевого отравления отравления кишечной палочкой: боль в животе, тошнота, рвота, диарея более 20 раз в сутки, возможно с кровью. Температура тела обычно повышается незначительно или остаётся в норме.

Кишечная палочка является наиболее распространенным патогеном, вызывающим менингит у новорождённых детей. Он имеет высокие показатели заболеваемости и смертности во всем мире.

В группе риска

-Взрослые в возрасте 65 лет и старше

-Дети младше 5 лет

-Люди с ослабленной иммунной системой, в том числе беременные

-Люди, которые путешествуют в определенные страны

Профилактика

Чтобы защитить себя от инфекций, вызванных кишечной палочкой, а также от других болезней пищевого происхождения, соблюдайте основные правила безопасности:

-Мойте руки, посуду и кухонные поверхности горячей мыльной водой до и после приготовления или приема пищи.

– Используйте отдельные разделочные доски для сырых продуктов и готовых

-Тщательно мойте фрукты и овощи, испотльзуйте щетку для овощей.

-Держите сырые продукты, особенно мясо и птицу, отдельно от готовых к употреблению продуктов.

– Охлаждайте или замораживайте скоропортящиеся продукты как можно быстрее.

– Избегайте непастеризованных соков, молочных продуктов.

– Не ешьте сырое тесто.

– Пейте бутилированную воду.

-Тщательно прожаривайте мясо.

Источник