Пцр диагностика при кишечных инфекциях

Рolymerase Сhain Reaction (PCR), иначе полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это прогрессивный метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний обнаружения генетических патологий, выявления неопластических клеток в начальной стадии рака.

ПЦР относится к генно-молекулярным исследованиям, что обеспечивает высокую точность показателей, минимизирует риск ложноположительных результатов. Для анализа используется биологический материал – кровь, моча, мазок, экскременты, ликвор (спинномозговая жидкость).

Специфика исследования методом ПЦР

Анализ кала на ПЦР выявляет возбудителей инфекционных заболеваний и дифференцирует их разновидность на генно-молекулярном уровне. В ходе исследования оцениваются макромолекулы ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) бактерий, простейших паразитов, глистов или РНК (рибонуклеиновой кислоты) вирусов. Для идентификации достаточно небольшого фрагмента патогена, обнаруженного в экскрементах.

В задачи молекулярной диагностики входит:

• обнаружение инфекционного агента;
• идентификация разновидности микроорганизма (вирус, бактерия, простейший и т. д.);
• дифференциация типа, рода, семейства и т. д.;
• определение тактики лечения, в соответствии с диагностированным заболеванием.

Образец биоматериала помещают в реактор (амплификатор), добавляют реакционную смесь. При последовательной смене температурного режима разрываются водородные цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты, образуются комплексы матрицы с праймерами – короткими генетическими фрагментами.

Реагенты достраивают матричную цепь и в ходе реакции амплификации формируют множественные копии возбудителя. При достаточном количестве копий амплификатор дает качественно-количественную оценку обнаруженному возбудителю.

Макромолекулы РНК и ДНК являются носителями уникальной информации, характерной для определенного вида, поэтому точность результатов ПЦР-диагностики максимально приближена к 100%.

Спектр инфекций, определяемых методом PCR по образцу кала

Полимеразную цепную реакцию используют для диагностики кишечных бактериальных и вирусных инфекций, различных видов гельминтозов, заражения организма простейшими паразитами.

Неполный перечень возбудителей и болезней, определяемых методом ПЦР

В большинстве случаев, анализ ПЦР кала назначают для выявления кишечных вирусов, бактерии хеликобактер пилори, лямблий и дизентерийных амеб. Определение глистной инвазии, как правило, проводят посредством обычного исследования экскрементов на яйца глистов. Бактериальные инфекции диагностируют с помощью анализа на дизгруппу.

Во многих клиниках существует стандартный ПЦР-скрининг на кишечные инфекции, вызванные бактериями и вирусами. Профиль включает определение восьми возбудителей (сальмонелла, шигелла, кампилобактерия, кишечная палочка, ротавирус, аденовирус, астровирус, норовирус).

Медицинские специалисты

ПЦР используют для уточнения спорных диагнозов, при получении ложноположительных и ложноотрицательных результатов других исследований. Анализ кала методом полимеразной цепной реакции могут назначить:

• гастроэнтеролог (взрослый или детский);
• инфекционист;
• гепатолог;
• педиатр;
• терапевт.
• проктолог;
• онколог;
• диетолог.

По желанию сдать анализ можно самостоятельно на возмездной основе в любом диагностическом центре Москвы и других городов РФ.

Ключевые достоинства PCR-диагностики

Метод полимеразной цепной реакции обладает значительными преимуществами, в сравнении с иными анализами:

• Подлинность идентификации возбудителей. Определение генно-молекулярной структуры патогенного микроорганизма обеспечивает высокую точность результата.
• Гиперчувствительность к инфекционным агентам. Для выявления патогена достаточно его молекулярного присутствия в образце кала.
• Оперативность проведения анализа. Исследование в условиях лаборатории занимает 1-3 дня.
• Комплексность. Одного образца кала достаточно для проведения анализа на несколько патогенных микроорганизмов.
• Универсальность. С помощью Рolymerase Сhain Reaction возможно определить практически любых инфекционных агентов. Кроме того, анализ обнаруживает не только активные патогены, но и неактивные (погибшие под воздействием лекарственных препаратов).
• Специфичность. В отличие от серологических методов, ПЦР не допускает перекрестных реакций иммуноглобулинов с близкородственными не комплементарными антигенами. Такая особенность исключает получение ложноположительных результатов анализа.

Важно! Проведение исследования методом ПЦР возможно только в специально оснащенных лабораториях при условии абсолютной стерильности и высокой профессиональной квалификации персонала. Присутствие любых посторонних ДНК в воздухе может повлиять на итоговые показатели анализа.

Ошибочные результаты PCR фиксируются при редком явлении генной мутации бактерий и вирусов.

Варианты контейнеров для сбора кала на анализы

Подготовка к сдаче биоматериала на анализ

Стандартные правила подготовки перед сбором экскрементов для ПЦР-диагностики включают:

• Отказ от приема любых медикаментов за 3-4 суток. Энтеросорбенты и антибиотики оказывают влияние на кишечную флору, слабительные лекарства – на моторику кишечника, препараты железа – на окрас экскрементов. Это может «смазать» картину итоговых результатов.
• Устранение из меню продуктов, провоцирующих интенсивное газообразование (блюда из бобовых, капусту, сдобу и ржаной хлеб), за 2-3 дня.
• Исключение ректальных суппозиториев и микроклизм.
• Отказ от употребления спиртных напитков за 2-3 дня.

При назначенной рентгенографии желудка с использованием бария обследование нельзя проходить до сдачи образца кала. Грудным детям за 3-4 дня не рекомендуется вводить новый прикорм.

Сбор биоматериала на анализ

Сбор и транспортировка биоматериала на исследование методом полимеразной цепной реакции допускается только в стерильном контейнере, который необходимо заранее приобрести в аптеке. Аптечный контейнер имеет герметичную крышку и снабжен специальной ложечкой. Сдать образец кала в лабораторию необходимо утром. Максимальный интервал доставки составляет 3 часа.

При сборе кала следует придерживаться алгоритма:

• Провести гигиену аноректальной зоны без использования мыла (геля).
• Опорожнить мочевой пузырь.
• Произвести дефекацию в судно (использовать бумагу или полиэтилен). Если собирать образец из унитаза, неизбежно попадание микробов.
• Заполнить аптечную емкость на 1/3 часть фрагментами фекалий (для этого использовать ложечку).
• Герметично закрыть крышку контейнера.
• Оперативно доставить биологический материал в лабораторию медицинского учреждения.

Важно! Запрещается пить слабительные лекарства (в том числе, травяные сборы и БАДы) и проводить процедуру клизмирования. Образец для исследования должен быть получен естественным способом.

Если незамедлительная транспортировка кала к месту исследования невозможна, плотно закрытый контейнер нужно поместить в холодильнике не более, чем на 12 часов. Хранение экскрементов в морозильной камере или при комнатной температуре делает их непригодными к молекулярному исследованию.

При сборе каловых масс с подгузника грудного ребенка важно следить, чтобы в контейнер не попали фрагменты гигиенической ткани. Женщинам не рекомендуется собирать кал для ПЦР-диагностики в первую неделю фолликулярной фазы менструального цикла.

Возможные примеси менструальной крови помешают исследованию. При необходимости проведения экстренного анализа влагалище необходимо закрыть гигиеническим тампоном. Молекулярная диагностика чувствительна к попаданию любых примесей.

Во время процедуры сбора биоматериала нельзя касаться внутренней стороны емкости, ложечки и крышки. Реакция амплификации может создать копии ДНК, случайно попавшей с рук. Итоговые данные будут ложными.

Результаты анализа

В указанное время пациент получает бланк с качественной интерпретацией результата. Варианты могут быть:

• «обнаружено» или «положительно» – наличие инфекционного заболевания;
• «не обнаружено» или «отрицательно» – отсутствие заражения.

Положительный результат при отсутствии выраженных проявлений болезни свидетельствует о латентном бессимптомном течении инфекции или пребывании возбудителя в стадии инкубации.

Пример бланка результатов молекулярного исследования кала

Итоги

ПЦР – один из самых информативных диагностических методов. Реакция амплификации базируется на определении ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний, что обеспечивает высокую точность результатов.

ПЦР анализ кала позволяет выявить вирусные и бактериальные кишечные инфекции, обнаружить инвазии простейших паразитов и гельминтов, а также на 100% идентифицировать патогенные микроорганизмы. Время выполнения исследования – 1-3 суток, в зависимости от загруженности лаборатории.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) – это целая группа заболеваний различной этиологии (бактерии, вирусы, простейшие), для которых характерен фекально-оральный механизм передачи. Источником заражения может быть пища, вода, грязные руки, инфицированные предметы быта. Для большинства ОКИ характерно довольно тяжелое течение с диареей, болью в животе, выраженной интоксикацией, особенно в детском возрасте.

Показания
Боли в животе, жидкий стул, урчание в животе (слышное на расстоянии), вздутие живота, боли вокруг пупка (усиливающиеся при дефекации), диарея. Исследование проводится для диагностики, а также дифференциальной диагностики острых форм кишечных инфекций, носительства, при обследовании контактных лиц, а также для оценки эффективности проведенного лечения.

Во время проведения скрининга идентифицируются:

Shigella spp. – грамотрицательные палочковидные микроорганизмы из семейства энтеробактерий. К роду Shigella относятся патогенные бактерии, которые являются возбудителями шигеллеза (бактериальной дизентерии).

E. coli (EIEC) – Escherichia coli, общепринятое сокращение E. сoli, (EIEC-энтеровазивные) очень близки с шигеллами, синтезируют и выделяют шигеллоподобный токсин, способны проникать в клетки слизистой кишечника и повреждать энтероциты, что приводит к образованию язвенных дефектов в слизистый кишечник.

Salmonella spp. – относятся к семейству энтеробактерий. Существует множество серовариантов Salmonella species, способных вызвать у человека инфекцию по типу гастроэнтероколита,  может протекать в форме острой кишечной инфекции, тяжелой генерализированной инфекции или бессимптомного носительства. Диагноз ставится только после выделения возбудителя, в данном исследовании после обнаружения его ДНК.

Campylobacter spp. В настоящее время кампилобактер рассматривается как ведущая причина бактериального гастроэнтерита у населения во всем мире. Молекулярно-генетический анализ для определения группы кампилобактерий позволяет детектировать те виды кампилобактерий, которые имеют этиологическую связь с острой кишечной инфекцией.

Adenovirus F – Аденовирусы группы F причина частых случаев вирусного гастроэнтерита. Наиболее часто аденовирусная кишечная инфекция наблюдается у детей в возрасте до 2 лет, однако также могут болеть подростки и взрослые люди. Молекулярно-генетический анализ аденовируса группы F обладает высокой диагностической чувствительностью и специфичностью.

Rotavirus A – ротавирусы А возбудители острой инфекции, при которой поражаются органы желудочно-кишечного тракта, сопровождается диареей, из-за которой возникает риск обезвоживания, нарушения электролитного и кислотно-щелочного баланса. Чаще гастроэнтеритом заболевают дети до 3 лет, у которых ротавирус составляет до 50% всех зарегистрированных случаев кишечных инфекций.

Norovirus 2 генотип – наиболее частый возбудитель вспышек ОКИ небактериальной этиологии. Эта особенность связана с низкой инфицирующей дозой и высокой устойчивостью в окружающей среде. ПЦР является “золотым стандартом” в клинической диагностике норовирусных инфекций.

Astrovirus – возбудитель острой кишечной инфекции. Астровирусная инфекция в большей степени поражает детей до 7 лет, причем наиболее часто заболевание наблюдаются у детей до года.При атаке вирусом поражается  эпителий кишечника и  Пейеровы бляшки. При этом развивается энтерит, сопровождающийся поносом и обезвоживанием организма. 

Тест ОКИ-скрининг позволяет выявить возбудителей бактериальных инфекций:

• ЖКТ-дизентерии,
• сальмонеллеза,
• кампилобактерной инфекции,
• эшерихиоза,
• возбудителей вирусных гастроэнтеритов:
• аденовирус,
• норовирус,
• ротавирус,
• астровирус. 

Метод ПЦР в реальном времени характеризуется высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, позволяет быстро и с высокой точностью определить возбудителя заболевания.

Подготовка
Исследование рекомендуется проводить до начала приема либо спустя 14 дней после приёма антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.  Исключается прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел  в течение 72 часов до сбора кала.

Сбор материала
Кал собирается после самопроизвольной дефекации в одноразовый пластиковый контейнер с герметичной крышкой и ложечкой-шпателем для отбора пробы. Следует избегать примеси к калу мочи и отделяемого половых органов.

Кал собирается в количестве не более 1/3 объёма контейнера, в объеме не менее 5 г (половина чайной ложки). Хранение при температуре +2+8 С. Материал необходимо доставить в медицинский офис в течение 24 часов.