Питательные среды для кишечной группы микроорганизмов

Питательные среды – искусственные субстраты, представляющие собой сбалансированную смесь питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, создающих наилучшие условия для роста микроорганизмов.

Питательные среды используют для культивирования микроорганизмов в лабораторной и производственной практике, для изучения свойств микроорганизмов, выделенных из организма (при диагностике инфекционных болезней) или из окружающей среды, для хранения и консервации чистых культур микроорганизмов. Питательные вещества, входящие в состав Питательных сред, необходимы для биосинтеза структурных и биохимических компонентов микроорганизмов и для получения ими энергии. Все химические реакции в живых организмах протекают в водной среде, поэтому вода — важный компонент любой П. с. и выполняет в ней роль источника кислорода и водорода.

Наилучший источник углерода для микроорганизмов — углеводы. Моносахариды, особенно гексозы, широко используются многими микроорганизмами. Одним из наиболее широко потребляемых микроорганизмами углеводов является глюкоза. Хороший источник углерода для многих грибков и актиномицет — маннит. Актиномицеты способны использовать как источник углерода глицерин. Органические к-ты также служат источником углерода, однако они могут привести к снижению pH среды и затормозить рост микроорганизмов, поэтому чаще применяют соли органических к-т. Нек-рые органические к-ты (лимонная, винная) вызывают в П. с. недостаток ионов металлов, что также влияет на рост микроорганизмов. Аминокислоты служат хорошим источником углерода и обеспечивают потребности микроорганизмов в нем. В качестве источника углерода разные микроорганизмы могут использовать различные соединения. Так, напр., нек-рые бактерии рода Pseudomonas способны использовать в качестве источника углерода и энергии любое из 90 различных органических соединений, включая сахара, жирные к-ты, органические к-ты и аминокислоты, а бактерии, окисляющие метан, утилизируют в качестве источника углерода и энергии только метан и метанол.

В Питательных средах должен быть доступный для микроорганизмов источник азота, который нужен для синтеза аминокислот, необходимых при построении клеточных белков, для синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований — структурных элементов нуклеиновых к-т. В качестве источника азота грибки и нек-рые бактерии используют нитраты, к-рые сначала восстанавливаются микроорганизмами и только после этого используются в процессах биосинтеза. Очень многие микроорганизмы нуждаются в восстановленном азоте, поэтому для их культивирования в П. с. в качестве источника азота вносят соли аммония. Потребность микроорганизмов в азоте может быть удовлетворена за счет органических соединений, напр, аминокислот, или более сложных продуктов неполного распада белков-пептонов. Эти соединения могут служить источником не только азота, но и углерода, серы, а также энергии. Поэтому П. с., содержащие в качестве субстрата белки животного или растительного происхождения или продукты их химического или ферментативного расщепления, обеспечивают рост и развитие подавляющего большинства микроорганизмов.

Фосфор необходим микроорганизмам для синтеза ряда важнейших компонентов клетки (ДНК, РНК, АТФ и пр.). Источником фосфора в П. с. могут быть фосфаты. Источником фосфатов в естественных средах (бульонах) являются нуклеиновые к-ты или продукты их расщепления (олигонуклеотиды, нуклеотиды).

В качестве источника серы в П. с. вносят сульфаты, а в питательных средах, приготовленных из белков естественного происхождения или продуктов их распада, источником серы служат нек-рые аминокислоты (цистин, цистеин).

В Питательных средах должны находиться минеральные соединения. Потребность микроорганизмов в минеральных элементах различна. В П. с. добавляют минеральные вещества — калий, магний, кальций, а также микроэлементы — железо, кобальт, медь, молибден, цинк, марганец. Функция минеральных соединений в метаболизме микроорганизмов сводится в основном к активации ферментов.

Для ряда бактерий — представителей родов Haemophilus, Corynebacterium, Lactobacillus, Brucella и некоторых других — требуется наличие в П. с. факторов роста (см. Бактериальные факторы роста), т. е. соединений, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов, но не синтезируемых ими. К числу таких веществ относятся аминокислоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания и др.

Одним из важных факторов, определяющих качество П. с., является оптимальная концентрация водородных ионов, оцениваемая показателем pH, и сохранение реакции среды в оптимальном диапазоне для данного микроорганизма при его культивировании. Предельные значения pH среды для микроорганизмов 4,0— 9,0, чаще всего оптимум pH близок к нейтральному. Патогенные микроорганизмы лучше растут на средах, pH которых 7,2—7,4, а грибки — при pH 4,0—6,0. Бактерии не растут на средах, pH которых ниже 4,0. Исключением являются уксуснокислые бактерии и серные бактерии, окисляющие серу до серной к-ты.

Метаболическая активность культивируемых микроорганизмов может привести к сдвигу реакции среды как в кислую, так и в щелочную сторону. Чтобы не допустить этого, в П. с. добавляют буферы. Чаще всего при приготовлении П. с. используют фосфатные буферы, состоящие из смеси однозамещенного и двузамещенного фосфатов (K2HPO4 и KH2PO4). Максимальная концентрация фосфата в среде, переносимая бактериями и грибками, соответствует 0,5%.

Питательные среды в зависимости от их свойств и назначения можно разделить на группы. По консистенции их делят на плотные, жидкие и полужидкие. Был предложен ряд веществ, уплотняющих П. с. (метил целлюлоза, крахмальный гель и др.). Практическое использование нашли агар — полисахарид, выделяемый из морских водорослей (см. Агар), желатина (см.) и силикагель, представляющий собой двуокись кремния. Агар обычно вносят в П. с. в концентрации 1—2%, желатину — 10—15%, а силикагель — 1,5% . Среды с желатиной используют лишь в специальных целях, т. к. желатиновый гель плавится при t° 25—30°, т. е. ниже оптимума роста большинства патогенных бактерий. В полужидких средах концентрацию агара снижают до 0,2-0,4%.

По характеру ингредиентов, входящих в состав П. с., их делят на П. с. неизвестного хим. состава, основанные на белках и продуктах их гидролиза, и среды известного состава (синтетические среды). П. с. неизвестного хим. состава могут быть простыми (основными) и сложными. Основные ингредиенты простых П. с.— продукты распада белков, полученные путем ферментативного или кислотного гидролиза. Ферментативный гидролиз осуществляют с помощью частично очищенных протеолитических ферментов (пепсина, трипсина, папаина) или путем обработки исходного сырья (мяса, рыбы, плаценты) тканями, содержащими эти ферменты, напр, поджелудочной железой, измельченными свиными желудками (см. Мартена бульон, Хоттингера агар). Обработка ферментами животных белков не сопровождается их полным гидролизом, в результате чего образуются так наз. пептоны (см.). На П. с., содержащих пептоны, микроорганизмы размножаются лучше, чем на полных гидролизатах белка или на смесях аминокислот, т. к. при ферментативном гидролизе животных или растительных тканей в них сохраняются лабильные факторы роста. О степени гидролиза белков в исходном полуфабрикате судят по содержанию в нем общего и аминного азота. Напр., в мясном переваре по Хоттингеру количество общего азота равно 1100—1200 мг/100 мл, количество аминного азота 650— 700 мг/100 мл, что соответствует расщеплению белка, равному 55—60%. Для роста микроорганизмов необходимо, чтобы в 100 мл бульона содержалось 250—300 мг общего азота, из которого 25—30% составляет аминный азот.

На основе простых Питательных сред готовят сложные, напр, среды, содержащие различные сахара (сахарный бульон, сахарный агар) или кровь (см. Борде — Жангу питательная среда, Левинталя среды, Файлдса среда, Цейсслера среда). К числу сложных П. с. натурального происхождения относят среды, содержащие сыворотку крови, и среды с добавлением асцитической жидкости. Напр., для выращивания кокков используют сывороточный агар, содержащий 10 или 20% сыворотки крови лошади или быка, или сывороточный бульон — мясо-пептонный бульон (см. Бульон мясо-пептонный) двойной концентрации, к к-рому добавлено 8—10% сыворотки крови. Нек-рые бактерии (менингококки, гонококки) лучше растут при наличии человеческого белка. Поэтому для их культивирования в П. с. вносят асцитическую жидкость. Асцит-бульон и асцит-агар готовят на основе простых П. с., к которым добавляют до 30% асцитической жидкости. К числу сложных П. с., приготовленных на основе простых сред, можно отнести молочные среды, яичные среды.

Все вышеперечисленные среды относятся к так наз. натуральным средам неизвестного состава, т. к. они содержат питательные субстраты естественного происхождения. Вместе с тем контроль за ростом и культивированием бактерий более эффективен, если использовать П. с. известного состава, содержащие воду и химически чистые соединения в определенных концентрациях. Такие среды называют синтетическими питательными средами (см.). Они имеют преимущество перед другими П. с. при изучении особенностей метаболизма микроорганизмов, т. к. дают возможность исследовать и оценивать метаболические реакции в зависимости от содержания в среде тех или иных компонентов. Сложность состава синтетических П. с. зависит от биосинтетической активности микроорганизмов, т. е. от их потребности в готовых факторах роста. Если для роста бактерий необходимы многие факторы роста, то синтетические П. с. весьма сложны по своему составу. Напр., для выращивания бактерий Leuconostoc mesenteroi-des требуется наличие в синтетической П. с. уксусной к-ты, 19 аминокислот, 4 пуринов и пиримидинов и 10 витаминов. Сложные П. с. готовят на основе минимальных П. с., в состав которых входит вода, минеральные соли, источник азота, чаще всего NH4Cl, и источник углерода и энергии, обычно глюкоза или другой легко усваиваемый углевод. К этой минимальной П. с. добавляют необходимые факторы роста. Напр., L-аминокислоты в количестве 10—20 мкг/мл. Следует учитывать, что D-изомеры аминокислот могут угнетать рост бактерий. Пурины, пиримидины, нуклеозиды и нуклеотиды обычно вносят в синтетические П. с. в конечной концентрации до 10 мкг/мл, витамины — ДО 1 мкг/мл.

По своему назначению П. с. делят на селективные (элективные) и дифференциально – диагностические. При использовании селективных П. с. можно отобрать выделяемый микроорганизм из смешанных культур или исследуемого материала путем создания условий, благоприятных для его культивирования и неблагоприятных для сопутствующих микроорганизмов других видов. Селективными П. с. являются, напр., щелочная пептонная вода и щелочный агар, на которых хорошо культивируются холерные вибрионы. Селективные условия иногда возникают в П. с. в результате метаболической активности выделяемого микроорганизма. Так, накопление молочнокислых бактерий осуществляют в среде, содержащей органический источник факторов роста и азота, напр, дрожжевой экстракт и глюкозу. После засева на такую среду полимикробного материала (сырое молоко, кусочки овощей, сточные воды) и инкубации при анаэробных условиях в П. с. постепенно накапливается молочная к-та. Среда интенсивно закисляется, что не мешает развитию молочнокислых бактерий, но угнетает (ингибирует) рост других бактерий, в частности бактерий сем. Enterobacteriaceae. В качестве П. с., селективных для патогенных представителей сем. Enterobacteriaceae, используют среды, содержащие желчь, желчный бульон (10— 20% желчи), среду Кауффманна (см. Кауффманна среда). Селективные условия для бактерий сем. Enterobacteriaceae создают также путем добавления в П. с. некоторых красителей: малахитового зеленого, бриллиантового зеленого, кристаллического фиолетового, метиленового синего и других, угнетающих рост грамположительных бактерий. В ряде случаев в качестве фактора прямой селекции бактерий, устойчивых к антибиотикам или другим противобактериальным средствам, в П. с. добавляют это вещество в концентрации, при которой клетки так наз. дикого типа погибают, а устойчивые особи сохраняются. Антибиотики используют в селективных П. с. не только для прямой селекции, но и для опосредованной. В качестве примера можно указать на жидкие синтетические П. с., к которым добавлен пенициллин или ампициллин. На этих средах можно отбирать любые ауксотрофные мутанты (см. Ауксотрофные микроорганизмы). Принципы «работы» этих сред основаны на способности антибиотиков подавлять рост размножающихся бактерий. Ауксотрофный мутант не растет в минимальной среде, поэтому он не погибает под влиянием указанных антибиотиков и его легко выделить затем на полноценных средах.

Широко распространены так наз. дифференциально-диагностические среды (см.), позволяющие выявить у микроорганизмов специфические особенности их обмена веществ и тем самым отдифференцировать выделенный микроорганизм от других родственных, но отличающихся своим метаболизмом (см. Левина среда, Расселла среда, Эндо среда). В целях стандартизации П. с., что необходимо для получения повторяющихся сравнимых результатов, широко используют сухие П. с., к-рые представляют собой высушенные до порошкообразного состояния П. с. различного состава. Широкую известность приобрели П. с., выпускаемые американской фирмой Дифко. Они используются как для культивирования различных микроорганизмов, так и для дифференциальной микробиологической диагностики. В СССР производят сухие Питательные среды для культивирования разнообразных микроорганизмов (сухой питательный бульон, сухой питательный агар), а также среды специального назначения, напр, для выращивания и выделения возбудителей бруцеллеза и туляремии, патогенных клостридий, дифтерийных бактерий, бактерий сем. Enterobacteriaceae, микобактерий и др.

Библиография: Козлов Ю. А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М., 1950; Роуз Э. Химическая микробиология, пер. с англ., с. 65, М., 1971; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 270 и др., М., 1973; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 41, М., 1973; Стейниер Р., Эдельберг Э. и Ингрем Дж. Мир микробов, пер. с англ., т. 1, с. 46, М., 1979.

Л. А. Замчук.