Ротовирусная кишечная инфекция лабораторная диагностика

Ротавирусные гастроэнтериты

В высокоразвитых странах более 60% острых гастроэнтеритов вызывают вирусы из семейства Reoviridae. Среди них доминируют ротавирусы. Род Rotavirus включает ротавирусы человека и вирусы, вызывающие диареи у животных. Последние для человека непатогенные. Ротавирусы человека вызывают, в основном, гастроэнтериты у детей до трех лет и пожилых людей. Возбудитель передается фекально-оральным способом при бытовых контактах. Высокая устойчивость вирусов во внешней среде способствует развитию вспышек гастроэнтеритов особенно в зимний период (до 90%). За белковыми антигенами ротавирусы разделяют на 4 серовариантив.

Материал для лабораторной диагностики

Материалом для лабораторной диагностики служат стул и кровь. Пробы кала принимают в первые часы и дни болезни в стерильные пенициллиновые флаконы и направляют в вирусологической лаборатории в контейнерах со льдом. Готовят 10-20% суспензию в растворе Хэнкса, центрифугируют 30 мин при 3000 об / мин. Центрифугат переносят в стерильный флакон, добавляют фреон 113 или 1000 ЕД / мл пенициллина и 500 ЕД / мл стрептомицина, помещают в холодильник на 10-12 часов. Кровь для серологических реакций принимают в первые 2-3 дня болезни и через 12-14 дней. Лабораторная диагностика вирусных диарей основывается на быстром обнаружении вирусов в кале с помощью электронной и иммунной электронной микроскопии, реакции непрямой гемагглютинации с антительным эритроцитарным вирусных диагностикумом. Используют также иммуноферментный анализ в твердофазном варианте реакцию коаглютинации, метод клонированных РНК-зондов и полимеразной цепной реакции. В первые дни болезни содержание ротавирусов в копроматериалах достигает 106-108 в 1 г, поэтому их обнаружение при прямой электронной микроскопии возможно без дополнительной концентрации. Каплю исследуемого материала наносят на специальные пленки из нитроцеллюлозы и микроскопируют при увеличении 50000. Метод чувствительный и надежный, позволяет быстро обнаружить вирус и исследовать его морфологию. При обнаружении 5-6 вирионов практически в каждом поле зрения можно достоверно подтвердить диагноз ротавирусного гастроэнтерита. Еще большее диагностическое значение имеет метод имуноелектроннои микроскопии. Принцип ее заключается в том, что иммунную противовирусную сыворотку добавляют к освещенной низкоскоростным центрифугированием суспензии фекалий, выдерживают 60 мин при комнатной температуре и еще 12 ч при 4 ° С, затем центрифугируют при 15000 об / мин для осаждения вирусных частиц и иммунных комплексов. Осадок ресуспендируют в 2-3 каплях дистиллированной воды, контрастируют в фосфорно-вольфрамовой кислоты и исследуют под электронным микроскопом. В препаратах обнаруживают характерные скопления ротавирусов. Высокая эффективность метода практически не зависит от исходной концентрации вирусов в исследуемых пробах.

Вирусологические исследования

Вирусологические исследования с целью выделения ротавирусов в культурах клеток или на лабораторных животных в рутинных вирусологических лабораториях не проводится. Наиболее широко в диагностике вирусных гастроэнтеритов используют иммуноферментный анализ. Принцип его заключается в том; что лунки полистироловых планшет сначала сенсибилизують антителами против ротавирусов, а затем добавляют в них освещенную суспензию фекалий, инкубируют 1 ч в термостате. Образован в лунках комплекс антиген-антитело после трехкратного промывания фосфатным буфером проявляют внесением антиглобулиновои сыворотки, конъюгированных с ферментом. После инкубации в термостате добавляют хромогенных субстратов до появления окрашенного продукта реакции. Учет результатов проводят с помощью иммуноферментного анализатора. В небольших лабораториях достаточно часто проводят реакцию обратной непрямой гемагглютинации с использованием антительного ротавирусного эритроцитарного диагностикума. Она проста по методике постановки, хотя и менее чувствительна по сравнению с реакцией ензиммичених антител. В практику лабораторной диагностики вирусных инфекций вводят также тест коаглютинации для индикации ротавирусного антигена в кале больных. На предметное стекло наносят каплю взвеси стафилококков (штамм Cowan 1), сенсибилизированных ротавирусной сывороткой, и добавляют каплю освещенного центрифугированием копроматериалу. При наличии ротавирусов через 30-60 с возникает агглютинация нагруженных антителами стафилококков. Очень чувствительным способом быстрой диагностики вирусных гастроэнтеритов является метод выявления вирусоспецифические РНК с помощью молекулярной гибридизации. Он основан на гибридизации меченых РНК-зондов, фиксированных на нитроцеллюлозные фильтрах. Мечение осуществляют биотином или ферментом, что значительно упрощает и удешевляет метод по сравнению с радиоизотопными метками.

Анализ ротавирусной РНК

Анализ ротавирусной РНК, несмотря на его дороговизну, все шире внедряется в практику, особенно после разработки метода полимеразной цепной реакции. Последняя является чувствительным и специфическим методом диагностики, который, безусловно, является диагностическим тестом нового поколения, так называемым “золотым стандартом”. Однако постановка этой реакции все еще требует высокой квалификации исследователя, дорогих реактивов и сложной аппаратуры.

Серологическая диагностика

Серологическая диагностика направлена на выявление специфических антител в парных сыворотках, взятых с двухнедельным интервалом. Для этой цели используют различные нейтрализационных или преципитацийни тесты и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Но в последнее время широко применяют иммуноферментный анализ. Раньше для серодиагностики широко ставили РСК с использованием в качестве антигена предварительно отобранные фекалии больных гастроэнтерит или ротавирусы телят. Но по своей чувствительностью и специфичностью она значительно уступает метода иммуноферментного анализа. Для выявления специфических антител к ротавирусов ставят также реакцию торможения непрямой гемагглютинации с парными сыворотками. Гастроэнтериты у детей могут также вызвать калицивирусы, астровирусы и вирусы Норволк. Все они выделяются с испражнениями в первые 2-3 дня заболевания, не размножаются в культурах клеток или слабо репродуцируются без цитопатического действия. Для лабораторной диагностики гастроенетеритив, вызванных данными вирусами, используют, в основном, метод иммунной электронной микроскопии. Других методов диагностики, доступных для вирусологических лабораторий, пока нет.

Ротавирусная инфекция – это инфекционное заболевание, которое вызывается специфическим возбудителем – ротавирусом. Название в переводе с латинского языка обозначает «вирус в виде колеса». Другое название болезни – кишечный грипп. Диагноз инфекции легко ставится путем лабораторных исследований кала. Сдать анализ на ротавирус можно в любой лаборатории. Существуют различные методики для его обнаружения.

Ротавирус предается через грязные руки фекально-оральным путем. Его без затруднений можно обнаружить в кале у детей. Паразитирует исключительно в эпителии тонкого кишечника. Источник инфекции – человек.

Клинико-диагностический метод

Диагноз ротавирусной инфекции поставить по симптомам невозможно. Можно только предположить о развитии этого заболевания. В определении развития любой инфекционной болезни важен сбор анамнеза (опрос). Врач обязан подробно выяснить, как развивалась болезнь у ребенка:

• когда родители впервые заметили ухудшение состояния малыша;
• какими были первые признаки, этиология – острое начало или постепенное развитие;
• выяснение вероятного источника инфекции, механизм заражения и пути передачи инфекции.

Правильный сбор эпидемиологических данных позволит предположить зарождение и развитие инфекции.

Признаки, характерные для ротавируса:

• в 95% случаев болеют дети от 6 месяцев до 2 лет;
• инкубационный период до 4 дней;
• начало болезни – однократная рвота и незначительное повышение температуры
• затем развивается очень жидкий, водянистый стул;
• в каловых массах никогда не содержатся примеси крови.

Правила забора кала на ротавирусную инфекцию

Для того чтобы результаты исследования были максимально достоверными, необходимо собрать каловые массы следуя определенным правилам. У грудничков кал на ротавирус собирают из подгузника после опорожнения кишечника.

Если ребенок уже пользуется горшком, то перед тем как усадить малыша, нужно провести дезинфекцию. Для этого горшок обдают кипятком несколько раз. На его стенках не должно остаться следов синтетических моющих и обеззараживающих средств.

Кал необходимо собрать сразу после дефекации чистым шпателем, если стул жидкий, можно просто вылить содержимое горшка в емкость для отправки в лабораторию. Общий объем каловых масс не должен превышать 20-30 мл. Тара для биологического материала должна плотно закрываться крышкой.

Для исследования необходимо забирать ту часть кала, где больше всего содержится патологических примесей – слизь, фибриновые пленки, гной, подозрительные частицы. Чем быстрее собрать анализ кала на ротавирус и отправить его в лабораторию, тем достовернее будет результат.

Методы исследования каловых масс на ротавирус

Ротавирусную инфекцию диагностируют несколькими способами. Их цель – определение самого вируса, антигенов к нему, обнаружение вирусной РНК. Серологические методы позволяют поставить точный диагноз за один день.

РЛА – реакция латекс-агглютинации

Это вид серологической диагностики, который широко применяют при инфекционных болезнях. Основан на реакции антиген-антитело. Для этого применяют специальный антиген, который представлен взвесью микроорганизмов, чувствительных эритроцитов и частиц латекса. При взаимодействии взвеси с антителами образуется комплекс, который выпадает в осадок, что свидетельствует о наличии ротавирусной инфекции.

ИФА – иммуноферментный анализ

Анализ на реакцию антиген-антитело состоит из двух этапов. Сначала происходит ферментативная реакция, затем – иммунный ответ. Принцип метода – связывание антитела с антигеном.

На специальном устройстве сорбируются антитела. Затем с ними связываются целевые антигены. Это все промывается специальным раствором. Затем наносятся антитела, помеченные специфическим ферментом. Делают еще одну промывку. Формируется комплекс из антигена и двух антител. Затем содержимое окрашивают. Чем интенсивнее цвет в образце, тем большее количество ротавируса находится в каловых массах.

Иммуноэлектронная микроскопия

Это реакция нейтрализации вирусов, которая проводится для их идентификации, а также для серологической диагностики вирусных инфекций. Принцип такого тестирования основан на развитии в организме иммунных реакций при заражении.

Для оценки клеточных реакций проводят тесты клеточной токсичности лимфоцитов относительно инфекционных агентов. Определяют способности лимфоцитов на ответную реакцию. Так идентифицируются противовирусные антитела. Реакция делается путем смешивания неизвестного вируса с антисывороткой.

Другие методы диагностики ротавируса

Выбор методов диагностики зависит от каждого конкретного случая. Для лабораторных исследований забирают кал и кровь. Основные диагностические способы определения инфекции:

• РДП – реакция диффузной преципитации.
• Твердообразная реакция коагглютинации.
• РПГ – реакция пассивной агглютинации.
• Иммунофлюоресцентный анализ.
• Радиоиммуный анализ.
• Выделение вируса в культуре клеток.
• ПЦР – полимеразная цепная реакция.
• Электрофорез ротавирусной РНК.
• Метод точечной гибридизации.
• РТГА – реакция торможения гемагглютинации.
• РНГА – реакция непрямой гемагглютинации.

Дифференциальная диагностика

Дифференциальный тест на ротавирусную инфекцию проводят тем пациентам, у которых есть другие острые кишечные инфекции (бактериальные и вирусные). Такая диагностика показана тогда, когда в симптоматике на первый план выходят признаки гастроэнтерита:

• пищевые токсикоинфекции;
• холера;
• острая дизентерия;
• вирусная диарея – аденовирус, астровирус, энтеровирусы ЕСНО и коксаки, вирус норфолк;
• сальмонеллез;
• эшерихиоз.

Определение ротавирусной инфекции в домашних условиях

Если нужно сделать срочный анализ или провести диагностику самостоятельно (в случае если состояние ребенка удовлетворительное и не требует госпитализации), делают тест на ротавирус в домашних условиях. Он не трудоемкий и требует минимальных временных затрат. С его помощью можно 100% определить наличие патогенного микроорганизма в каловых массах.

Иммунохроматографический экспресс-тест на ротавирус основан на применении моноклональных и поликлональных мышиных антител к вирусному антигену. Антитела соединены с красителем и расположены на мембране тестовой кассеты. Тест имеет высокую степень специфичности и чувствительности.

Что входит в состав тест-системы:

• кассеты для теста – 20 шт.;
• одноразовые пипетки – 20 шт.;
• пластиковые пробирки, содержащие по 2 мл экстрагента, – 20 шт.;
• аппликаторы для забора материала – 20 шт.;
• инструкция по использованию тест-системы.

Нельзя использовать систему, если нарушена целостность ее упаковки или истек срок годности. Во время проведения теста пользоваться одноразовыми перчатками.

Кал для исследования берется только после проявления симптомов болезни. Наиболее точные результаты исследования бывают на 3-5 день заболевания.

Приготовление экстрагированной пробы: открыть пластмассовую пробирку и с помощью аппликатора внести в нее кал размером с горошину, затем плотно закрыть и встряхивать до полного растворения кала в экстрагенте. Затем пробирка должна отстояться до того времени, пока крупные частицы не осядут на дно. Для проведения теста реагент должен быть комнатной температуры.

Как проводится тест: достать из упаковки кассету, открыть пробирку с биоматериалом. С помощью пипетки в лунку для проб капнуть 6 полных капель, постепенно давая впитываться каждой предыдущей капле. Максимальное время, сколько готовится результат, составляет 10 минут.

Оценка результата:

• одна полоска в районе контрольной зоны (С) – результат отрицательный, кал не содержит ротавирус;
• одна цветная полоска в контрольной зоне и одна полоска (четко различимая) в тестовой зоне – результат положительный, в пробе содержится ротавирус;
• если в контрольной зоне отсутствует полоса – тест неопределенный, выполнен некачественно, с нарушением инструкции, необходимо провести повторный анализ с использованием другой тест-кассеты.

Тест подходит только для определения ротавирусной инфекции в каловых массах. Если в испражнениях содержится кровь, это может дать ложноположительный результат.

Ротавирусной инфекцией болеет 100% населения в детском возрасте. Опасность эта патология представляет только для младенцев и детей до 3 лет. Для ребенка она опасна такими осложнениями, как сильное обезвоживание и поражение нервной системы – судороги, вплоть до остановки дыхания. Поэтому важна своевременная и точная диагностика ротавируса, ее дифференциация с другими инфекционными болезнями.