Среда для идентификации кишечной палочки
МУК 4.2.992-00
Дата введения 2001-02-04
1. РАЗРАБОТАНЫ
Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России
(Л.Г.Подунова, Н.С.Кривопалова, Р.С.Сорокина), Центром
госсанэпиднадзора в Тульской области (Л.И.Шишкина, Т.А.Попова,
А.Я.Сыпченко, Н.М.Корнеева), Государственным научным центром
прикладной микробиологии (М.В.Храмов).
2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации – Первым
заместителем министра здравоохранения Российской Федерации
Г.Г.Онищенко 4 ноября 2000 г.
3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1.
Область применения
1. Настоящие методические
указания предназначены для бактериологических лабораторий центров
государственного санитарно-эпидемиологического надзора, других
учреждений системы здравоохранения Российской Федерации,
осуществляющих бактериологическую диагностику острых кишечных
инфекций с гемоколитом и развитием гемолитико-уремического
синдрома, а также обследование контактных в очагах заболевания и
контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых
продуктов.
2. Методические указания
определяют методы обнаружения, выделения и идентификации
энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli О157:Н7 и
разработаны в связи с отсутствием в настоящее время нормативных
документов по данному разделу бактериологических исследований.
3. Методические указания
являются обязательными при контроле продуктов детского питания,
молочных и мясных продуктов в ходе проведения противоэпидемических
мероприятий при возникновении вспышек, а также осуществления
санитарно-эпидемиологического надзора.
4. Настоящие методические
указания созданы с целью унификации и дальнейшего совершенствования
бактериологических методов выделения и идентификации
энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli О157:Н7 в связи с
регистрацией данной патологии на территории Российской Федерации, а
также роста заболеваемости вспышечного характера и спорадической за
рубежом.
2.
Сущность метода
Методические указания
содержат описание микробиологического исследования с целью
выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.
coli О157:Н7 из биоматериала от больных неосложненными диареями,
острыми кишечными инфекциями с гемоколитом и развитием
гемолитико-уремического синдрома, от контактных в очаге, а также
пищевых продуктов, сырья.
Предлагаемый
дифференциально-диагностический метод основан на использовании
некоторых особенностей биохимических свойств данного
микроорганизма: отсутствии фермента -D-глюкуронидазы и способности
ферментировать сорбитол, а также на наличии у Е. coli О157:Н7
такого “маркера”, как продукция веротоксинов (VT1, VT2).
Для осуществления
возможности практического использования данной методики в течение
короткого периода времени разработана отечественная питательная
среда “Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар” (ФС 42-0027-00) для выделения
Е. coli О157:Н7 из клинического материала, объектов окружающей
среды (разработчик – Государственный научный центр прикладной
микробиологии, отделение “Питательные среды”, г.Оболенск
Серпуховского района Московской области), а также созданы
диагностические сыворотки для реакции агглютинации и методика
определения веротоксинов в клиническом материале.
Огромный интерес,
проявляемый к острым кишечным инфекциям с гемолитико-уремическим
синдромом (ГУС) со стороны научных центров и практического
здравоохранения за рубежом и в нашей стране, закономерен.
Количество регистрируемых
заболеваний острыми кишечными инфекциями с гемолитико-уремическим
синдромом, как вспышечного характера, так и спорадических, ежегодно
возрастает (США, Канада, Финляндия, Япония, Европа).
Этиологическим фактором
этих заболеваний являются энтерогеморрагические кишечные палочки,
продуцирующие веротоксины (шигаподобные токсины). Они представлены
довольно большим разнообразием серологических вариантов, из которых
Е. coil О157:Н7 имеет наибольшее эпидемиологическое значение в
качестве причин неосложненных диарей и кровавого поноса с
последующим развитием ГУС.
К
настоящему времени биология эшерихии Е. соli О157:Н7,
эпидемиология, патогенез и диагностика связанных с ней заболеваний
достаточно изучены.
Первые сведения о
выделении Е. coli О157:Н7 и регистрация данной патологии в нашей
стране имели место в Тульской области, где диагностика острых
кишечных инфекций с гемолитико-уремическим синдромом начата с конца
1996 года.
Результаты выделения Е.
coli О157:Н7 из клинического материала от детей, больных ОКИ,
сырья, пищевых продуктов (сырого мяса, молока) получены в 1997-99
гг.: установление этиологического фактора (Е. coli О157:Н7) случаев
острых кишечных инфекций, осложненных гемолитико-уремическим
синдромом, составило в Тульской области 43%, высеваемость Е. coli
О157:Н7 из пищевых продуктов и сырья 1,96%; высеваемость культур от
животноводов и доярок ферм – 9%.
Наибольшему риску
подвержены дети до 5 лет и пожилые люди.
Естественным резервуаром
бактерий Е. coli О157:Н7, патогенных для человека, служит крупный
рогатый скот, овцы. Наиболее частый путь распространения этой
инфекции – пищевой. Основным фактором передачи является сырая
говядина, особенно мясной фарш, мясные полуфабрикаты, прошедшие
недостаточную термическую обработку, сырое молоко. Отмечены случаи
передачи возбудителя через воду.
3.
Нормативные ссылки
3.1. “Основы
законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан”
от 22.07.93 г.N 5487-1.
3.2. Федеральный
закон “О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения” от 30
марта 1999 г. N 52-ФЗ.
3.3. СанПиН
2.3.2.560-96 “Гигиенические требования к качеству и безопасности
продовольственного сырья и пищевых продуктов”*.
___________________
*
Действуют СанПиН
2.3.2.1078-01. – Примечание “КОДЕКС”.
3.4. ГОСТ
26668-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для
микробиологических исследований”.
3.5. ГОСТ
26669-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для
микробиологических анализов”.
3.6. ГОСТ
26670-91 “Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов”.
3.7. ГОСТ
10444.1-84 “Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов,
питательных сред, применяемых в микробиологическом
анализе”.
3.8. ГОСТ Р 50474-93 “Продукты пищевые. Методы
выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек
(колиформных бактерий)”.
3.9. ГОСТ Р 50480-93 “Продукты пищевые. Методы
выявления бактерий рода Salmonella”.
3.10. ГОСТ
9225-84 “Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа”.
3.11. ГОСТ
9792-73 “Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины,
говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила
приемки и методы отбора проб”.
3.12. ГОСТ
9958-81 “Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы
бактериологического анализа”.
3.13. ГОСТ
21237-75 “Мясо. Методы микробиологического анализа”.
3.14. ГОСТ
4288-76 “Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса.
Правила приемки и методы испытания”.
3.15. ГОСТ Р 50396.0-92 “Мясо птицы, субпродукты и
полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к
микробиологическим исследованиям”.
3.16. ГОСТ
7702.2.2-93 “Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы
выявления и определения количества бактерий группы кишечных
палочек”.
3.17. ГОСТ
7702.2.3-93 “Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы
выявления сальмонелл”.
3.18. МУ
04-723/3 от 17.12.84 г. Методические указания по
микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых
энтеробактериями.
3.19. Инструкция к
применению “Набора реагентов для выявления веротоксина у эшерихий”
(фирма “Seiken”, Япония).
4.
Методы забора, доставки проб клинического материала от больных и
контактных
Важным условием выделения
эшерихий Е. coli О157:Н7 из клинического материала является отбор и
доставка его в лабораторию в возможно ранние сроки: оптимальными
сроками являются 1-3 день от момента заболевания.
У
больных интенсивность выделения возбудителя снижается, достигая 50%
и более низкого уровня через 5-8 дней от начала заболевания.
Гемолитико-уремический синдром обычно развивается спустя, как
минимум, одну неделю после первых признаков диареи, и вероятность
обнаружения возбудителя к этому времени существенно
уменьшается.
Материалом для
бактериологического исследования служат в первую очередь
испражнения, моча.
Испражнения собирают в
консервант, в качестве которого можно использовать
фосфатно-буферную или глицериновую смеси. В случае доставки
материала в течение 2 часов с момента забора нативные испражнения
отбирают в стерильные флаконы.
При обследовании
контактных лиц с целью выявления бактерионосителей возможно взятие
материала ректальными тампонами, проволочными петлями.
Мочу после туалета
наружных половых органов собирают в стерильную посуду. Перед
посевом мочу центрифугируют и засевают осадок. В случае небольшого
количества осадка засевают нативную мочу в среду обогащения двойной
концентрации в равных объемах (приложение 1).
5.
Методы подготовки пищевых продуктов для бактериологического
исследования и схемы посева на питательные среды
Методы отбора проб,
хранение и подготовка их к анализу регламентированы в действующих
нормативных документах на конкретный вид продукта (раздел 3
“Нормативные ссылки”).
Проведение испытаний
различных пищевых продуктов устанавливает единый метод выявления в
определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий в
соответствии с ГОСТ Р 50474-93
“Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества
бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)”. По
классификации кишечных палочек Е. coli 0157:Н7 относится к
энтерогеморрагическим, энтеропатогенным кишечным палочкам, поэтому
выявление ее как патогена необходимо проводить в 25 г продукта.
Возможно выявление Е. coli О157:Н7 в других объемах,
регламентированных нормативной документацией на конкретный вид
продукта, а также СанПиН
2.3.2.560-96 “Гигиенические требования к качеству и
безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов”
(приложения 2, 3).
6.
Проведение анализа
Принципы
бактериологического исследования с целью выделения Е. coli О157:Н7
не отличаются от общепринятых для возбудителей острых кишечных
инфекций и включают методы классического бактериологического
исследования, основанные на выделении чистой культуры
микроорганизма и последующей его идентификации по
культурально-морфологическим, биохимическим, антигенным свойствам.
Основным критерием отнесения штамма к группе энтерогеморрагических
эшерихий являются данные, подтверждающие продукцию веротоксинов.
Штаммы, не продуцирующие токсинов, не могут считаться возбудителями
эшерихиозов у людей.
6.1. Посев клинического
материала с целью выделения Е. coli О157:Н7 проводится на
питательную среду Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар (прямой посев) и в
соотношении 1:5 в среды накопления, которыми могут служить бульон
лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью (ГОСТ Р 50474-93), GN Enrichment Broth
асс. to HAJNA (Cat. N 10756, фирма “MERCK”, Германия). При
отсутствии нативного материала испражнения, забранные в консервант,
засевают в среду обогащения двойной концентрации (приложение
1).
6.2. Посев пищевых
продуктов для выявления БГКП (колиформных бактерий) в определенной
навеске продукта проводится в соответствии с ГОСТ Р 50474-93. Дополнительной
питательной средой для выявления Е. coli О157:Н7 является Сорбитол
E. coli О157:Н7 агар (приложение 2), потому что плотная питательная
среда, используемая для выделения колиформных бактерий (Эндо), не
может быть использована для целенаправленного поиска E. coli
О151:Н7, т.к. данный микроорганизм разлагает лактозу подобно другим
эшерихиям.
6.3. Подготовку пищевых
продуктов для выявления E. coli О157:Н7 с применением сред
обогащения осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 50480-93 “Продукты пищевые.
Методы выявления бактерий рода Salmonella”, но в качестве сред
обогащения могут быть использованы среда Кесслера, трипказо-соевый
бульон, бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью,
Грам-негативный бульон (GN-бульон). После термостатирования посевов
при 37 °С в течение 18-24 ч проводят высев на плотную среду
Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар, обладающую дифференциальными и
селективными свойствами (приложение 3).
Отличительным
биохимическим свойством Е. coli О157:Н7 является отсутствие
способности ферментировать сорбитол. Для выделения штаммов Е. coli
О157:Н7 необходимо использовать Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар или
среды зарубежного производства: Fluorocult Е. coli О157:Н7 Agar (Cat. N 1.04036);
Sorbitol MacConkey Agar (SMAC-agar) Cat. N 1.09207;
Fluorocult HC Agar acс. to SZABO Cat. N 1.09206 (фирма
“MERCK”, Германия).
Характеристика роста Е.
coli О157:Н7 на плотных питательных средах представлена в
табл.1.
Таблица
1
Характеристика роста Е. coli О157:Н7 на плотных
питательных средах
Питательная | Характер |
Среда ЭНДО | Колонии |
Сорбитол Е. coli О157:Н7 | Колония |
Fluorocult Е. coli О157:Н7 | Прозрачные или |
Простой питательный | Колонии |
Агар Плоскирева, | Роста нет. |
Кровяной агар | Колонии |
Если на чашке с Сорбитол
Е. coli О157:Н7 агаром выросли 1-2 сорбитол-отрицательных колонии,
то серологические исследования проводят после посева на одну из
сред для первичной дифференциации: агар Клиглера, Олькеницкого,
Ресселя. В случае роста на чашке Петри однотипной культуры с 3-5
колониями проводят серологическую идентификацию на стекле с “О”- и
“Н”-сыворотками к антигенам Е. coli О157:Н7, либо с латексным
антительным диагностикумом.
Не менее 5
сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду для первичной
идентификации. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С 18-24 часа.
При получении на следующий день результатов, подтверждающих
принадлежность культуры к роду эшерихий (ферментация глюкозы и
лактозы с образованием кислоты и газа, отсутствие HS), проводят дальнейшую биохимическую и
серологическую идентификацию (приложения 2, 3).
7.
Биохимические свойства и серологическая идентификация Е. соli
O157:Н7
Серологическая
идентификация предусматривает выявление “О”- и “Н”-антигенов у
эшерихий Е. coli О157:Н7.
Определение “О”- и
“Н”-антигенов проводится в обычной реакции агглютинации на стекле с
эшерихиозными сыворотками к Е. соli O157:Н7, выпускаемыми АООТ
“Биомед” имени И.И.Мечникова (Московская область, Красногорский
район, с.Петрово-Дальнее) или латексным антительным диагностикумом
производства ГНЦ ПМ (Московская область, Серпуховской район,
г.Оболенск). Реакция агглютинации осуществляется в соответствии с
наставлениями по применению данных сывороток.
Необходимо отметить, что
Е. coli О157:Н7 имеет антигенные связи с другими эшерихиями
(табл.2).
Таблица
2
Антигенные связи Е. соli О157:Н7 и других эшерихий
Е. coli | Наименование | |
О157 | Н7 | |
О2-О17 | – | – |
О19-О49 | ||
О51-О54 | ||
О56-О115 | ||
О117-О164 | ||
О50 О116 | + | – |
О1; О18; О55 | – | + |
О157:Н7 | + | + |
Все штаммы, дающие
положительную реакцию агглютинации, подлежат обязательной
биохимической идентификации для подтверждения видовой
принадлежности. Биохимические свойства Е. coli О157:Н7 отражены в
табл.3.
Таблица
3
Основные биохимические свойства Е. coli О157:Н7
N | Тест или | Наименование | |
Е. соli | Е. coli | ||
1 | Сорбитол | – | + |
2 | -D-глюкуронидаза | – | + |
3 | Цитрат Симмонса | – | – |
4 | Мочевина | – | – |
5 | Малонат натрия | – | – |
6 | Сероводород | – | – |
7 | Фенилаланиндезаминаза | – | |
Источник
Устал с поисками информации? Мы тебе поможем!
Грамотрицательные палочки
1. селективное обогащение (накопление):
· жидкая среда Кесслера с поплавком (с лактозой): культивирование – (36±1)°С, для E.coli используют температуру (43±1)°С в течение 24-48 ч. Проверяется сбраживание лактозы и образование газа. На среде Кесслера кишечная палочка дает обесцвечивание и помутнение среды связи с подкислением среды, и образование газа в поплавке.
· жидкая элективная среда Кода: культивирование – 37°С 18-24 ч. Проверяется сбраживание лактозы и образование газа. Признаком роста лактозоположительных энтеробактерий (БГКП, E. coli) является изменение цвета среды с темно-зеленого до ярко-желтого.
2. плотные дифференциально-диагностические среды:
· среда Эндо: культивировать – (37±1)°С в течение 18-20 ч. На среде Эндо Е.соli колонии имеют круглую форму, ровный, четко очерченный край, матовую поверхность, малиново-красный темно-красный цвет, который зависит от способности культуры расщеплять лактозу с образованием кислоты, с металлическим блеском. Колонии от бледно-розового до темно-красного цвета с нечетким металлическим блеском. Диаметр колоний 1,5-2,5 или 2,0-3,0 мм.
· среда Левина: культивировать – (37±1)°С в течение 24-48 ч. Колонии кишечной палочки темно-синего (темно-фиолетового) цвета с зеленым металлическим блеском (или без него) диаметром 1,5-2,0 мм, в остальном они не отличаются от колоний кишечной палочки на среде Эндо.
· скошенный РПА (МПА): культивировать – 37°С 18-20 ч. На поверхности агара кишечная палочка образует влажный, блестящий налет сероватого цвета, слегка опалесцирующий в проходящем свете.
3. морфология клеток:
· грамотрицательные палочки.
4. биохимические тесты:
E. coli образует индол.
Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность МПА (РПА) или среды, приготовленной из ПА. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36±1)°С. У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1,1×1,5×2 6 мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.
· способность образовывать индол: культуру высевают в пробирку с бульоном Хоттингера или МПБ (РПБ) с триптофаном. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового. Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача. Для этого к 5 см 24-часовой культуры добавляют 1 мл одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию. E.coli образует индол.
E. coli не образует ацетоин.
· способность образовывать ацетоин (реакция Фогес-Проскауэра): культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 мл отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 мл раствора 1-нафтола и 0,2 мл раствора гидроокиси калия. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Проявление розового окрашивания через 15-60 мин. указывает на положительную реакцию. E.coli не образует ацетоин.
E. coli не утилизирует цитрат.
· способность утилизировать цитрат: культуру высевают в пробирки со средой Козера или на поверхность среды Симмонса. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.
E.coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).
· определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот): культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 мл культуральной жидкости для проведения реакции Фогес-Проскауэра. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 48 ч. К 5 мл культуральной жидкости прибавляют 5-10 капель реактива Кларка. Появление через 1 мин. красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до рН ниже 5,0.
E.coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.
· определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы: культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре (44±1)°С в течение 24 ч. При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках ТСА или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа. Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиглера. Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды. У культур типичных для Е.соli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде Гисса с целлобиозой, при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
Е.соli не образует сероводород.
· определение образования сероводорода: образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или ТСА после инкубирования посевов при температуре (36±1)°С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.
Идентификация Salmonella
Salmonella грамотрицательные палочки с закругленными концами.
1. первичное неселективное накопление (обогащение):
· ЗПВ (забуференная пептонная вода): навеску продукта засевают в среду. Соотношение продукта и ЗПВ 1:9. Рост проявляется в помутнении среды. Культивирование – (36±1)ºС 18±2 ч.
· магниевая среда (хлормагниевая): Засевают непосредственно продукт. Культивирование – (36±1)ºС 24-48 ч.
2. селективное обогащение:
· жидкая элективная среда Кода: культивировать. Признаком роста лактозоотрицательных энтеробактерий (сальмонелл) является помутнение среды без изменения цвета.
· магниевая среда (хлормагниевая): засевают культуру, полученную после предварительной инкубации. Культивирование – (36±1)ºС 24-48 ч.
· селенитовая среда (селенитовый бульон Лейфсона): засевают культуру, полученную после предварительной инкубации. Культивирование – 35ºС 18-24 ч.
· среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон): засевают культуру, полученную после предварительной инкубации. Культивирование – (41,5±1)ºС 24±3 ч. Рост проявляется диффузным помутнением среды.
· тетратионатная среда Мюллер-Кауфман (МКТ-бульон): засевают культуру, полученную после предварительной инкубации. Культивирование – (43±1)ºС 24-48 ч. или (37±1)ºС 24±3 ч.
3. плотные дифференциально-диагностические среды:
· питательная среда Эндо: низкоселективная среда. Культивирование – (37±1)ºС 18-20 ч. На среде сальмонеллы круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоотрицательным энтеробактериям, в том числе сальмонелл.
· среда Плоскирева (или бактоагар Плоскирева): среднеселективная среда. Культивирование – (37±1)ºС 18-20 ч. На средах колонии сальмонелл бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо. Бесцветные, нежные, гладкие, круглые диаметром 1,0-2,0 мм.
· среда ВСА (висмут-сульфит агар): высокоселективная среда. Культивирование – (37±1)ºС 24-48 ч. На ВСА колонии сальмонеллы имеют черный цвет с характерным сероватым металлическим блеском в виде ободка, а также зеленоватого цвета с темным центром и темно-зеленым ободком и с пигментированием (потемнением) среды под колониями.
· среда Левина: низкоселективная среда. Культивирование – (37±1)ºС 24-48 ч. На среде колонии сальмонеллы прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.
· ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар): культивирование – (37±1)ºС 24-48 ч. Колонии сальмонелл имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, что принадлежит цвету индикатора. Бактерии рода сальмонелл сероводородотрицательные образуют на среде розовые колонии с темным розовым центром. Лактозоположительные бактерии рода сальмонелла на среде дают желтые колонии с почернением или без него. Круглые, блестящие, бесцветные с черным центром или без него, диаметром 1,0-3,0 мм.
· бриллиантовый зеленый агар: культивирование – (37±1)ºС 48 ч. На среде сальмонеллы образуют красноватые или розовые, почти белые колонии (их цвет зависит от штамма и срока культивирования). Лактозо- и сахарозоположительные сальмонеллы образуют зеленоватые колонии, окруженные яркой желто-зеленой зоной.
· сальмонелла-шигелла агар (SS-агар): культивировать 37°С 18-20 ч. Колонии бесцветные, диаметром 1-2 мм.
· среда Плоскирева: культивировать 37°С 18-20 ч. Колонии малинового цвета, круглые, выпуклые, гладкие диаметром 1,5-2,5 мм.
· скошенный РПА или ПА: Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. Рост прозрачный по штриху.
4. морфология клеток:
· сальмонеллы грамотрицательные палочки с закругленными концами.
5. биохимические тесты:
Salmonella ферментирует глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирует лактозу и сахарозу.
· способность ферментировать сахара (лактозу, глюкозу и сахарозу): на трехсахарном агаре (ТСА, TSI-агар), среде Олькеницкого (3 сахара с мочевиной) среде Клиглера (2 сахара): Посев осуществляется петлей на скошенную поверхность и уколом в столбик с помощью бактериальной иглы. Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. Пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы, или обоих сахаров. Красная или неизменившая цвета среда говорит о лактозо- и сахарозоотрицательных сальмонеллах. Пожелтение столбика среды указывает на ферментацию глюкозы. Красный или неизменившийся цвет – глюкоза отрицательная. Столбик с разрывом агара или пузырьками газа – образование газа. Отсутствие разрывов и пузырьков – газ не образуется. Агар Клиглера – по скошенной поверхности учитываю только ферментацию лактозы.
Salmonella образует сероводород.
· способность образовывать сероводород: Посев осуществляется петлей на скошенную поверхность и уколом в столбик ТСА, среду Олькеницкого, Клиглера с помощью бактериальной иглы. Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. Почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.
Salmonella не расщепляет мочевину.
· способность расщеплять мочевину: культуру со скошенного РПА (ПА) пересевают штрихом на поверхность агара с мочевиной (агар Кристенсена с мочевиной). Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. При положительной реакции – расщеплении мочевины с выделением аммония цвет среды фенолового красного меняется от розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч. инкубации.
Salmonella не образует ацетоин (реакция Фогес-Проскауэра отрицательная).
· способность образовывать ацетоин: реакция Фогес-Проскауэра. Культуру со скошенного РПА (ПА) пересевают в МПБ (РМБ) с глюкозой или суспендируют петлей в стерильной пробирке с 3 мл VP среды. Культивирование – (36±1)ºС 48 ч. После культивирования к 1 мл отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 мл раствора α-нафтола и 0,2 мл раствора гидроокиси калия концентрации 400 г/л. Или прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового или светло-красного окрашивания через 15 мин. указывает на положительную реакцию.
Salmonella не образует индол.
· способность образовывать индол: культуру со скошенного РПА (ПА) пересевают в бульон Хоттингера или в МПБ (РПБ) с L-триптофаном, или в 5 мл триптон/триптофановой среды. Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. После инкубирования, к посеву прибавляют по 1 мл реактива Эрлиха и Ковача. Образование красного слоя указывает на положительную реакцию.
Salmonella не сбраживает сахарозу, но сбраживает манит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.
· способность сбраживать манит и сахарозу: культуру со скошенного РПА (ПА) пересевают с среды Гисса с маннитом и сахарозой. Культивирование – (36±1)ºС 24 ч.
Большинство штаммов Salmonella подвижны.
· способность двигаться: культуру со скошенного РПА (ПА) пересевают уколом с помощью бактериальной иглы в полужидкий МПА. Культивирование – (36±1)ºС 24 ч. При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных – вдоль места укола.
Salmonella paratyphi не образует L-лизиндекарбоксилазу, остальные образуют.
· образование L-лизиндекарбоксилазы: инокулируют снизу жидкую L-лизиндекарбоксилазную среду. Культивирование – (37±1)ºС 24±3 ч. Помутнение и пурпурный цвет среды указывает на положительную реакцию. Желтый цвет – на отрицательную.
Salmonella, кроме Salmonella arizonae не обладают β-галактозидазой.
· наличие β-галактозидазы: суспендируют петлей суточную культуру со скошенного РПА (ПА) в 0,25 мл физраствора, прибавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку. Помещают ее на водяную баню при температуре 37ºС и оставляют примерно на 5 мин. Затем добавляют0,25 мл реактива для определения β-галактозидазы и перемешивают. Оставляют пробирку на водяной бане при 37ºС в течение (24±3) ч, наблюдая за изменением цвета через определенные промежутки времени. Желтый цвет указывает на положительную реакцию. Изменение цвета обнаруживается примерно через 20 мин.
Дата добавления: 2017-01-21; просмотров: 3664 | Нарушение авторских прав | Мы поможем в написании ваших работ!
| Изречения для студентов
Читайте также:
Рекомендуемый контект:
Поиск на сайте:
© 2015-2021 lektsii.org – Контакты – Последнее добавление
Источник