Вирус эпизоотической диареи свиней

ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ СВИНЕЙ

В.А.СЕРГЕЕВ, профессор, доктор биологических наук, О.В.СЕРГЕЕВ, кандидат биологических наук, НИИ вирусологи им. Д.И.Ивановского

В 1971 в Англии среди откормочных свиней и подсосных поросят наблюдали неизвестные до того острые вспышки диареи. Клинические проявления заболевания были схожи с трансмиссивным гастроэнтеритом (ТГС) кроме той важной разницы, что у подсосных поросят не наблюдали рвоту [2, 38]. Вирус ТГС и другие известные энтеропатогенные агенты были исключены. Аналогичное заболевание, наблюдавшееся в других Европейских странах, получило название «эпизоотическая вирусная диарея» (EVD).

В 1978 была установлена связь наблюдаемых вспышек с корона-подобным вирусом [6, 40]. Экспериментальное заражение прототипным штаммом CV777, вызвало диарею у поросят и свиней на откорме [9]. Возбудитель болезни получил название «вирус эпизоотической диареи свиней» (PEDV) [39].

Этиология

Вирус ЭДС на основе антигенных и генетических критериев относят к группе 1 рода Сoronavirus семейства Сoronaviridae вместе с вирусом ТГС, коронавирусами кошек, собак и человека 229Е. Геном прототипного штамма СV777 имеет размер 28033 нуклеотидов [1, 17, 30, 50]. Подобно другим коронавирусам, вирус ЭДС содержит 3 белка: негликолизированный белок N (57-58 кД), который вместе с геномной РНК формирует нуклеокапсид вируса; трансмембранный гликопротеин М (27-32 кД) и пепломерный гликопротеин S (180-200 кД) [11; 16; 50].

Нет доказательства существования более одного серотипа вируса ЭДС.

Прототипный штамм CV777 по нуклеотидной последовательности гена N гомологичен корейским и японским изолятам более чем на 90% [31,37,53].

Частицы вируса ЭДС по морфологии и морфогенезу обладают всеми характеристиками семейства Coronaviridae [6, 40]. Средний диаметр 130 нм (95-190 нм). Булавовидные пепломеры (шипы) имеют длину 18-23 нм и располагаются радиально от сердцевины, формируя «корону». Сборка частиц происходит путём почкования через внутренние цитоплазматические мембраны [13, 48].

Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру и хлороформу. Его плотность в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3. Вирус, адаптированный к культуре клеток, теряет инфекционность при >60°С в течение 30 мин., но сохраняет стабильность при 50°С. При 4°С вирус стабилен при рН 4,0-9,0, при 37°С он стабилен при рН 6,5-7,5.
Вирус ЭДС не обладает гемагглютинирующей активностью [36].

Культивирование. Аттенуация

Многие типы культур клеток были безуспешно использованы для культивирования вируса ЭДС. Впоследствии было найдено, что культура клеток Vero (почка зелёной мартышки) поддерживает серийное размножение вируса ЭДС. В культуре клеток Vero вирус был выделен из тонкого кишечника как естественно больных, так и экспериментально инфицированных поросят. Полевые изоляты вируса проходили до 100 серийных пассажей в клетках Vero. Поддерживающая среда в период размножения вируса содержала трипсин в концентрации 1-2 мкг/мл. Размножение вируса сопровождается выраженным цитопатическим эффектом (ЦПЭ), который выражается в вакуолизации клеток и формировании синцития (симпласты, содержащие до 100 ядер). При выделении вируса из фекалий больных поросят несколько «слепых» пассажей требовалось провести перед появлением ЦПЭ в клетках Vero [19, 32, 33, 36, 43, 47].

При серийном пассировании вирус (105,0 ТЦД50/мл) вносили в культуру клеток через 48 часов после посева клеток, когда монослой ещё полностью не сформировался. После развития выраженного ЦПЭ, вирус выделяли из клеток путём повторного замораживания-оттаивания [19, 23]. Титр вируса достигал пика (около 105,5 БОЕ/мл) через 15 часов после инокуляции [19, 36]. Изолят KPEDV-9 на 90 пассаже достиг титра 106,5 ТЦД50/мл [33], a изолят DR13 на 55 пассаже достиг уровня 106,0 ТЦД50/мл и до 100 пассажа накапливался в пределах 106,5 – 107,0 ТЦД50/мл [47].

Вирус ЭДС, длительно адаптированный к клеткам Vero успешно размножался в культурах клеток как свиного, так и несвиного происхождения: МА 104, CPK и ESK в присутствии трипсина [32]. В линиях клеток свиньи KSEK-6 и IBRS-2 изолят P-5V серийно размножался даже без добавления трипсина [23], хотя роль трипсина в повышении уровня репродукции вируса ЭДС была показана экспериментально [7].

Имеются сведения о выделении вируса ЭДС в культурах клеток мочевого пузыря и почки свиньи, выращенных в плашках, покрытых коллагеном, в присутствии трипсина в поддерживающей среде [43].

Эпизоотология

В 1982 – 1990 годах антитела к ВЭДС были обнаружены у свиней во многих странах Европы и Азии. Сообщения о наличии вируса ЭДС в Северной и Южной Америке отсутствуют [41]. В Европе вспышки ЭДС регистрировали редко, тогда как в Азии часто происходят массовые вспышки ЭДС, сопровождающиеся высокой смертностью поросят. По массовости, остроте и суровости течения их нельзя клинически отличить от типичных острых вспышек ТГС.

Фекально-оральный путь является главным, если не единственным, путём передачи вируса ЭДС. Острые вспышки инфекции в восприимчивых хозяйствах часто происходят через 4-5 дней после продажи или покупки свиней. Вирус ЭДС не отличается от вируса ТГС в отношении способов передачи, но похоже, что первый легче вызывает персистентную инфекцию в хозяйстве после окончания острой вспышки[41].

Клинические признаки

Главным и часто единственным клиническим признаком ЭДС является водянистая диарея. Вспышки могут значительно варьировать по заболеваемости и летальности. На некоторых фермах заболевают свиньи всех возрастов, и заболеваемость приближается к 100%. ЭДС очень сходна с ТГС за исключением более медленного распространения и несколько более низкой смертности новорождённых поросят. Поросята в возрасте до 1 недели могут погибнуть от дегидрации после 3-4-дневной диареи. Средняя смертность поросят обычно составляет 50%, но может достигать 100%. Взрослые свиньи выздоравливают примерно через 1 неделю. После острой вспышки диарея у поросят может наблюдаться в течение 2-3 недель после отъёма. В последние годы типичные острые вспышки с высокой смертностью новорождённых поросят в Европе наблюдают редко, но они часто происходят в Корее [5] и Японии [48].

При острой вспышке ЭДС в хозяйстве все откормочные свиньи заболевают с развитием диареи в течение недели. У животных отмечают частичную потерю аппетита, депрессию и водянистую диарею. К концу откормочного периода ЭДС часто протекает тяжелее, чем ТГС. Животные проявляют большую болезненность в области живота и, как правило, выздоравливают через 7-10 дней. Смертность составляла 1-3%, обычно на ранней стадии диареи или даже до проявления диареи. При некропсии у таких животных обнаруживают острый некроз спинной мускулатуры. Наиболее высокая смертность наблюдается у свиней, чувствительных к стрессу. По сравнению с ТГС ЭДС распространяется медленнее. Распространение вируса из одного свинарника в другой может занять 4-6 недель, некоторые свинарники, не имеющие контакта между собой, могут оставаться свободными от инфекции.

Патогенез

Вирус размножался в цитоплазме эпителиальных клеток ворсинок тонкой и ободочной кишок, что было показано иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией. Инфицированные эпителиальные клетки обнаруживали уже через 12-18 часов, а их максимальное количество наблюдали через 24-36 часов после заражения. Репликация вируса в тонком кишечнике приводила к разрушению эпителиальных клеток и укорочению ворсинок. Отношение высоты ворсинок к глубине крипт уменьшается до 3:1 по сравнению с нормой 7:1. Дегенерацию инфицированных клеток эпителия ободочной кишки не наблюдали [41].

Трехдневные поросята, заражённые орально прототипным штаммом СV777 вируса ЭДС, заболевали через 22-36 часов после инокуляции. Изменения в тонком кишечнике у поросят при ЭДС подобны изменениям при ТГС. Однако репликация вируса и развитие инфекционного процесса при ЭДС протекают медленнее, чем при ТГС [9,10].

Репликация вируса ЭДС y поросят была обнаружена только в кишечном тракте. Shibata et al. [43] показали, что свиньи в возрасте 2 дней – 12 недель, заражённые полевым вирусом ЭДС, проявляли устойчивость к заражению в зависимости от возраста. Погибали только 2-7-дневные поросята.

Клинические признаки ЭДС, описанные в Корее и Японии, идентичны тем, которые наблюдали в Европе, за исключением того, что нет доказательств репликации азиатских штаммов вируса в ободочной кишке [26, 48] и не было случаев внезапной смерти откормочных животных.

Патанатомические изменения выражаются повреждением только тонкого кишечника, который заполняется и растягивается жёлтой жидкостью [14, 15, 48]. Вакуолизация и слущивание энтероцитов ворсинок тонкого кишечника начинаются через 24 часа после заражения и совпадают с началом диареи. Инфицированные ворсинки быстро укорачиваются и их энзиматическая активность резко снижается. Морфологические изменения ворсинок подтверждены сканирующей ЭМ [12], которая показала большое сходство изменений при ЭДС и ТГС. Гистопатологические изменения в ободочной кишке не были выявлены.

Формирование вирионов в основном происходит внутри клеток и завершается путём почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [13, 21]. В ободочной кишке наблюдали лишь некоторые изменения в энтероцитах. Они содержали вирусные частицы, но не подвергались слущиванию.

Диагноз на ЭДС нельзя поставить только на основании клинических признаков. Острые вспышки ЭДС у свиней всех возрастов нельзя клинически отличить от таковых при ТГС. Этиологический диагноз можно установить на основе обнаружения вируса ЭДС, или его антигена, или специфических антител. Наиболее чувствительными, быстрыми и надёжными методами являются прямая иммунофлуоресценция (ИФ) [19, 43] и иммуногистохимия срезов тонкого кишечника новорожденных поросят [18, 48]. Однако эти исследования можно проводить только на поросятах, убитых во время острой фазы диареи, предпочтительно в течение первых 2 дней после начала болезни. Данные методы также часто ненадёжны при исследовании кишечника свиней, погибающих естественно в результате резкого нарушения пищеварения.

Частицы вируса ЭДС можно обнаружить в фекалиях методом прямой электронной микроскопии (ЭМ), хотя их выявить нелегко, особенно если пепломерная «корона» вириона утрачена или видна нечётко. Количество позитивных фекальных образцов, полученных от экспериментально заражённых поросят в первый день диареи, по данным ЭМ, максимально составляло 73%. Для того, чтобы различить вирусы ЭДС и ТГС, имеющих одинаковую морфологию, требуется иммуноэлектронная микроскопия.

Для выявления антигенов вируса ЭДС в фекалиях, а также для демонстрации специфических антител в сыворотке крови был создан ряд наборов иммуноферментного анализа (ИФA). Они чувствительны и надёжны для постановки диагноза, особенно группового. Для антигенных версий ИФA использовали поли- и моноклональные антитела и вирус, размноженный в организме поросят [2, 3, 51].

Для антительного ИФA антигеном является полуочищенный вирус, размноженный либо в организме животных, либо в культуре клеток [2, 4, 33], или вирусные белки S и N, выделенные из инфицированных клеток Vero [29]. Антитела также обнаруживали в молоке свиноматок методом ИФА [8].

Другие диагностические тесты на обнаружение вируса ЭДС в фекалиях включают обратную транскрипцию – полимеразную цепную реакцию (RT-PCR) [22, 25]. RT-PCR была разработана для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС в образцах кишечника и фекалий больных свиней [27, 28].

Специфические антитела к вирусу ЭДС можно обнаружить в сыворотке крови свиней после естественного или экспериментального заражения, используя ИФA, блокирующий ИФA, непрямую ИФ и нейтрализацию вируса ЭДС в культуре клеток Vero [2, 20, 41, 43]. Сыворотки крови инфицированных свиней следует получать не раньше 2 недель после начала диареи.

Прoфилактика и контроль

Так как ЭДС не распространяется очень быстро, можно применять общесанитарные превентивные меры и на время задержать проникновение вируса в репродукторные свинарники с опоросами и новорождёнными поросятами. Задержка естественного заражения поросят до достижения более старшего возраста может значительно уменьшить заболеваемость и гибель свиней. Вместе с тем по аналогии с ТГС ранний контакт супоросных свиноматок с инфицированными вирусом ЭДС фекалиями или скармливание суспензии кишечника больных поросят стимулирует лактогенный иммунитет и сокращает вспышку ЭДС в хозяйстве. Если вирус циркулирует в последовательных помётах подсосных поросят, можно попытаться прекратить его перманентную передачу путём перемещения свиней сразу после окончания подсосного периода в другое место не менее, чем на 4 недели. Одновременно с этим поступление новых животных в хозяйство должно быть временно прекращено.

B Азии, в отличие от Европы, вспышки ЭДС оказались настолько суровыми, что возникла потребность создания вакцины против ЭДС. Возможным путём создания вакцины является аттенуация вируса длительным пассированием в культуре клеток. Cерийное пассирование приводит к снижению патогенности вируса для новорожденных поросят и свиноматок, но сохраняет его способность вызывать протективный иммунный ответ у привитых свиней [34, 47].

Аттенуированный штамм KPEDV-9 на 93 пассаже в культуре клеток Vero был использован для орального и внутримышечного введения безмолозивным поросятам в возрасте 1-4 дня. Из 8 поросят, получивших 10 мл суспензии вируса в концентрации 108 ТЦД50/мл перорально, только 3 развили мягкую диарею. Все поросята, привитые вирусом в дозах 106 и 107 ТЦД50/мл, не показали каких-либо признаков инфекции [34]. Штамм DR13 на 100 пассаже в клетках Vero не вызвал диарею, анорексию и виремию у новорождённых поросят и беременных свиноматок. Только 1 из 14 поросят проявлял слабую диарею [47]. Эти данные были подтверждены в последующих экспериментах [44, 45].

Супоросные свиноматки, привитые внутримышечно аттенуированным штаммом KPEDV-9 в дозе 107 ТЦД50, развили высокие титры противовирусных антител в крови и молозиве, которые легко выявляли в ИФА. Новорождённых поросят, родившихся от вакцинированных свиноматок, заражали перорально полевым вирулентным вирусом ЭДС в дозах 10 и 5 ЛД50 и наблюдали в течение 2 недель. При 10 ЛД50 смертность была 20% по сравнению со 100% в контрольной группе, при 5 ЛД50 все иммунные поросята выжили по сравнению с гибелью 60% контрольных поросят [34]. Аналогичные результаты были получены в опытах со штаммом DR13, аттенуированным подобным способом [47]. Было также показано, что оральное введение аттенуированного DR13 приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [46]. Однако эффективность применения аттенуированных штаммов в полевых условиях предстоит установить.

В Японии с 1997 для профилактики свиноматок применяют коммерческую живую вакцину из штамма Р-5V, аттенуированного в культуре клеток. Вакцина считается эффективной, хотя не все свиноматки развивают выраженный лактогенный иммунитет [49].

Известны опыты пассивной защиты поросят иммуноглобулинами несвиного происхождения. Оральное введение новорождённым поросятам желтка куриных яиц или коровьего молозива, содержащих иммуноглобулины к вирусу ЭДС, оказывало иммунопрофилактический эффект, предотвращая болезнь или уменьшая смертность [35, 42].

Представляет также интерес получение антигена вируса ЭДС в трансгенных растениях. Синтез рекомбинантного гликопротеина S вируса в трансгенном табаке составил 2,1% от общего растворимого белка, что делает это растение потенциальным объектом для создания «кормовой вакцины» [24].

ЛИТЕРАТУРА

• 1. Bridgen A., J. Gen. Virol. -1993, 74, 1795.
• 2. Callebaut P., DeBouck P., Pensaert M. Vet. Microbiol. – 1982. – Vol.7. – P.295-306.
• 3. Carvajal A., et al. Proc. 3d Congr. ESVV – 1995, 516.
• 4. Carvajal A., et al. J. Vet. Diagn. Invest. – 1995, 1.7, 60.
• 5. Chae C., et al. Vet. Rec. – 2000, 18. 606.
• 6. Chasey D., Cartwright S.F. Res. Vet. Sci. 1978. 255.
• 7. Сruz M D. J., Shin H.J. // Proc. 88 Ann. Meet. Chicago, Illinois. – 2007.
• 8.DeArribaM.L.,etal.//Proc.3dCongr.ESVV–1995.–222.
• 9. DeBouck P., Pensaert M. // Am. J. Vet. Res. 1980. 41. 219.
• 10. DeBouck P., Pensaert M., Coussement W. Vet. Microbiol. 1981. 6. 157.
• 11. Duarte M., Laude H. J. Gen. Virol. 1994. 75. 1195.
• 12. Ducatelle R., et al. Zentralbl. Veterinarmed. B. 1981. 28. 483.
• 13. Ducatelle R., et al. Arch. Virol. 1981. 68. 35.
• 14. Ducatelle R., et al. Vet. Pathol. – 1982. 19. 57.
• 15. Ducatelle R., et al. Vet. Pathol. 1982. 19. P. 46.
• 16. Egberink H.F., et al. Am. J. Vet. Res. 1988. 49. 1320.
• 17. Gonzales J.M., et al. // Arch. Virol. 2003. 148. 2207.
• 18. Guscetti F., et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. 5. 412.
• 19. Hofmann M., Wyler R. J. Clin. Microbiol. 1988. 26. 2235.
• 20.HofmannM.,WylerR.Vet.Microbiol.1990.21.263.
• 21. Horvath I., Moscari E. Arch. Virol. 1981. 68. 103.
• 22. Ishikawa K.,. et al. J. Virol. Methods 1997. 69. – 191.
• 23. Kadoi K et al. // New Microbiol. 2002. 25. 285.
• 24.KangT.J.,etal.Vaccine2005.23.2294.
• 25.KimO.,ChaeC.Vet.Pathol,2000,37,62.
• 26.KimO.,ChaeC.J.Comp.Pathol.2003,129.55.
• 27. Kim O., et al. Vet. Rec. 2000. 146. 637.
• 28. Kim S.Y., Song D.S., Park B.K. J. Vet. Diagn. Invest. 2001. 13. 516.
• 29. Knuchel M., et al. Vet. Microbiol. – 1992, – 32, 134.
• 30. Kocherhans R., et al. // Virus Genes – 2001, 23, 137.
• 31. Kubota S., et al. J. Vet. Med. Sci. – 1999, 61. 827.
• 32. Kusanagi K., J. Vet. Med. Sci. 1992, 54, 313.
• 33. Kweon C.H., et al. Korean J. Vet. Res, 1994, 34, 321.
• 34. Kweon C.H., et al. Vaccine, 1999, 17. 2546.
• 35. Kweon C.H., et al. J.Vet. Med. Sci, 2000, 62, 961.
• 36. Lee H.K., Yeo S.G. J. Vet. Clin, 2003, 20, 150.
• 37. Lee H.K., Yeo S.G. // Virus Genes 2003, 26, 207.
• 38. Oldham J. Pig farming (Oct. suppl.) – 1972, 72.
• 39. Pensaert M., Callebaut P., DeBouck P. Proc. Congr. Int. Pig Vet. Soc. – 1982. – Vol.7. – P.52.
• 40. Pensaert M., DeBouck P. // Arch. Virol, 1978, 58, 243.
• 41. Pensaert M., Yeo S.G. Disease of swine, 2006, 367.
• 42. Shibata I., Tsuda T., Mori M. J. Vet. Med. Sci, 2001, 63, 655.
• 43. Shibata I., et al. Vet. Microbiol, 2000, 72, 173.
• 44. Song D.S., et al. J. Virol. Meth, 2006, 133, 27.
• 45. Song D.S., et al.// J. Swine Health Prod, 2005, 13, 269.
• 46. Song D.S., et al. Res. Vet. Sci, 2007, 82, 134.
• 47. Song D.S., et al. Vaccine, 2003, 21. 1833.
• 48. Sueyoshi M., et al. J. Clin. Pathol, 1995, 113, 59.
• 49. Usami Y., et al. J. Jpn. Vet. Med. Assoc, 1998, 51, 652.
• 50. Utiger A., et al. Virus Genes, 1995, 10, 137.
• 51. Van Nieгwstadt A.P., Zetstra T. // Am. J. Vet. Res, 1991, 52, 1044.
• 52. Wood E.N. Vet. Res, 1977, 100, 243.
• 53. Yeo S.G., et al. Virus Genes, 2003, 26, 239.